复方甘草酸苷对溃疡性结肠炎大鼠结肠组织NF-κB p65及COX-2表达的影响

卢光新, 吕 飞, 杜 勇, 杨艳果, 周春芳, 金灵莉, 杨建业

(湖北医药学院附属十堰市人民医院1. 消化内科; 2. 临床研究所, 十堰市 442000)

复方甘草酸苷对溃疡性结肠炎大鼠结肠组织NF-κB p65及COX-2表达的影响

卢光新1, 吕 飞1, 杜 勇1, 杨艳果1, 周春芳1, 金灵莉1, 杨建业2

(湖北医药学院附属十堰市人民医院1. 消化内科; 2. 临床研究所, 十堰市 442000)

目的 观察复方甘草酸苷对溃疡性结肠炎大鼠核因子-κB p65(NF-κB p65)及环氧合酶2(COX-2)的影响并探讨其作用机制。方法 成年SD大鼠40只, 随机分成4组, 即正常对照组、模型组、复方甘草酸苷治疗组及柳氮磺胺吡啶(SASP)治疗组。正常对照组不做任何处理，其余3组用2.5%三硝基苯磺酸钠/乙醇溶液灌肠制备溃疡性结肠炎模型，模型组用生理盐水灌肠3 d后处死，复方甘草酸苷治疗组每日用复方甘草酸苷溶液(40 mg/kg)连续灌肠7 d后处死; SASP治疗组每日用SASP溶液(0.5 g/kg)连续灌肠7 d后处死。经不同处理和治疗后，运用免疫组化染色(SABC法)检测NF-κB p65 及 COX-2表达。结果 与正常对照组相比，模型组、复方甘草酸苷治疗组及SASP治疗组的NF-κB p65表达水平明显上升(P＜0.01); COX-2的表达水平亦明显上升(P＜0.01);与模型组相比，复方甘草酸苷组及SASP治疗组的NF-κB p65、COX-2的表达水平均明显下降(P＜0.01)。结论 复方甘草酸苷对大鼠溃疡性结肠炎有良好的治疗作用，其作用机制可能与降低大鼠结肠组织中NF-κB p65 及 COX-2的表达有关。

溃疡性结肠炎(UC); 三硝基苯磺酸 /乙醇; 复方甘草酸苷; 核因子 -κB p65(NF-κB p65);环氧合酶2(COX-2)

迄今为止，溃疡性结肠炎(UC)的特异性致病因素和发病机制仍无准确定论，大多数学者认为UC的发生是免疫、遗传、环境及肠道细菌等多种因素共同作用的结果。近年来多项研究证实，免疫反应的异常是造成UC炎症和组织损伤的内在重要因素。而细胞因子则在介导这一异常的免疫反应中起重要作用，肠道细胞因子表达异常是 UC发病的重要机制之一[1～2]。核因子 -κB(NF-κB)可促进多种炎性细胞因子，如IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、TNF-α等基因的转录[3]。NF-κB家族由5个成员组成, 其中p65具有显著的促炎特性, 在调控靶基因的转录中起着关键性的作用, 所以, NF-κB活化可能是UC发生发展的关键点。而环氧合酶2(COX-2)作为炎症反应中的主要诱导酶，其在UC发病中的作用日益受到重视，国外临床及实验研究表明COX-2在该炎症发展过程中起重要作用[4]。作者前期研究采用复方甘草酸苷治疗UC取得明显疗效，为了探讨其作用机制，本实验主要研究复方甘草酸苷对UC大鼠NF-κB p65及COX-2的影响。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级SD大鼠40只, 雌雄各半, 分笼饲养, 体质量180～220 g，由湖北医药学院动物实验中心提供[SCXK(鄂)2011-0008]。饲养于SPF动物设施。

1.2 主要试剂与仪器

兔抗大鼠 NF-κB p65(Sigma-AldrichChemical Co);免疫组化试剂盒由博士得生物工程有限公司生产，批号: DEC 022005; 乙二胺四乙酸(EDTA) 抗原修复液 (用蒸馏水稀释后使用)，由北京中杉金桥生物技术有限公司生产，批号: 501101; SFC-18型生物显微镜由厦门麦克奥迪公司生产; 3K-30Z型高速冷冻离心机由Sigma公司生产; A5002型酶标仪由Tecan公司生产。

复方甘草酸苷主要中药成分是甘草, 有效作用成分为甘草提取物甘草酸苷，其化学结构类似于皮质激素，溶液制备方法: 将80 mg复方甘草酸苷粉剂溶于100 ml盐水中，按每日40 mg/kg剂量灌肠。

1.3 UC 模型的建立及处理

[5]，大鼠禁食24 h(不禁水)，随机分4组，A组为正常对照组; B、C、D组造模采用2.5%TNBS/乙醇(V/V)溶液灌肠, 1.0 ml/200 g体质量, 戊巴比妥钠30 mg/ kg腹腔麻醉后, 用聚乙烯导管插入大鼠结肠内距肛门口8 cm处，然后用注射器注入上述灌肠液, 并将大鼠倒置1 min。24 h后, B组模型对照组采用生理盐水灌肠, 1.0 ml/200 g体质量，连续灌肠3 d后处死取材；C组每日用复方甘草酸苷溶液(40 mg/kg)，连续灌肠7 d后处死取材; D组每日用SASP溶液(0.5 g/kg)，连续灌肠7 d后处死取材。

模型成功标准如下，①全身症状: 大鼠毛色无华、变脆、嗜卧扎堆，并出现懒动、拱背，体重下降; ②消化道症状: 厌食，大便次数增多，大便末端有粘液或脓血点等表现; ③随机处死UC模型大鼠，取结肠组织予以评分，并在光镜下观察病理情况: 病变结肠粘膜充血水肿、上皮脱落、坏死、溃疡形成、粘膜下层有大量的炎性细胞浸润、有隐窝脓肿形成

1.4 标本处理

4组大鼠予以相应处理后，用脱颈法处死，腹主动脉采血后，解剖大鼠，选择结肠病变最严重的部位剪取2.0 cm，放入体积分数10%中性缓冲福尔马林溶液中固定。

1.5 免疫组织化学检测步骤

切片常规脱蜡至水。体积分数30%H2O21份+蒸馏水9份混合, 室温10 min以灭活内源性酶。蒸馏水洗3次。热修复抗原: 将切片浸入0.02 mol/LPBS缓冲溶液(pH7.2～7.6), 微波炉加热至沸腾后断电, 保持温度5～10 min后, 室温放置。冷却后滴加体积分数5%BSA封闭液, 37℃恒温箱反应30 min。甩去多余液体, 不洗。滴加抗体稀释液稀释的一抗(稀释度1∶75), 4℃过夜。PBS(pH7.2～7.6)洗20 min×2次。滴加生物素化山羊抗兔IgG, 37℃ 30 min。PBS(pH7.2～7.6)洗20 min×2次。滴加试剂SABC，37℃ 30 min。PBS(pH7.2～7.6)洗30 min×3次。DAB显色:使用DAB显色试剂盒(AR1022)。取1 ml蒸馏水，加试剂盒中A、B、C试剂各1滴，混匀后加至切片。室温显色，镜下控制反应时间。也可自配显色剂显色。蒸馏水洗涤。苏木素轻度复染。脱水，透明，封片。显微镜观察。

1.6 判定方法[6]

采用半定量积分法计算免疫组织化学染色积分, 即分别对每张切片的阳性细胞及阳性细胞着色程度进行分级记分, 结果以两项之和表示 阳性细胞率:每张切片检测5个视野(400倍)，所见的阳性细胞分为0～4 级(共5级) 0级为阴性，记0分; 1级阳性细胞占1%～25% 记1分; 2级阳性细胞占 26% ～50% 记 2 分; 3 级阳性细胞占 51% ～ 75% 记 3 分;4 级阳性细胞占 76%～100%记4 分。染色强度:显微镜下观察, 仅细胞核着蓝色者为阴性，细胞质或核膜上呈棕黄色为阳性 强度分0～ 3 级 (共4 级)0 级为阴性记0 分; 1 级为弱阳性染色记1 分; 2 级为阳性染色记 2 分; 3 级为强阳性染色记3 分。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 NF-κB p65的表达

正常对照组NF-κB p65呈弱表达，模型组结肠组织NF-κB p65的表达明显高于正常对照组，对比有统计学意义(P＜0.05); 复方甘草酸苷治疗组与SASP治疗组结肠组织NF-κB p65表达高于正常对照组 (P＜0.05), 复方甘草酸苷治疗组结肠组织NF-κB p65表达与SASP治疗比较无明显差别 (P＞0.05)(表1)。

2.2 COX-2的表达

正常对照组COX-2呈弱表达, 模型组结肠组织COX-2的表达明显高于正常对照组, 对比有统计学意义 (P＜0.05); 复方甘草酸苷治疗组与SASP 组结肠组织COX-2表达高于正常对照组, 对比有统计学意义 (P＜0.05), 复方甘草酸苷治疗组结肠组织COX-2表达与SASP治疗组比较无明显差别 (P＞0.05)(表2)。

表 1 各组大鼠结肠组织NF-κB p65表达情况

表 2 各组大鼠结肠组织COX-2表达情况

3 讨论

UC是一种肠道慢性非特异性炎症，虽然其发病机制尚不明确，但是细胞因子在UC发病中的作用已得到公认。近年研究发现，NF-κB调控着UC患者细胞因子的释放，从而参与了UC肠道的炎症和免疫反应，提示NF-κB与 UC发病关系密切[7]。NF-κB是高度保守的一种转录因子，广泛存在于各种组织中，NF-κB是一种能与免疫球蛋白轻链基因的增强子B序列(GGGACTTTCC) 特异性结合的核蛋白，广泛存在于各种组织中，能与许多细胞基因的启动子和增强子中的闎转录序列位发生特异性结合, 在免疫和炎症反应、细胞生长、病毒感染及某些疾病急性期反应等方面起着重要作用。NF-κB可以调控任何含有B位点的基因转录，包括细胞因子及其受体(IL-1、IL-6，IL-8，TNF-α，IL-2R)粘附分子(ICAM-1，VCAM-1)促进或抑制凋亡蛋白(Bcl-xL，Fsa，FasL) 急性期反应蛋白(CRP) 趋化因子(RANTFS，MCP，MTP) 补体、生长因子、酶分子、转录因子等，释放的细胞因子又可反过来进一步活化NF-κB，由此形成一个正反馈调节，使炎症不断放大[8]。

环氧化酶(cyclooxygenase, COX)至少存在两种异构体，即环氧化酶-1(COX-1)和环氧化酶-2(COX-2)。COX-2是在各种刺激因子作用下激活表达的诱导酶[9]，COX-2的高表达可促进花生四烯酸的代谢，复方甘草酸苷主要有效成分为甘草酸苷，其化学结构类似于皮质激素，具有抗炎、抗过敏的作用，可以直接与花生四烯酸代谢途径的启动酶磷脂酶A2结合，还可以与作用于花生四烯酸，使其产生炎性介质的脂氧合酶结合，选择性地阻碍这些酶的磷酸化而抑制其活化，减少炎性介质的产生。本实验复方甘草酸苷治疗组中COX-2的表达水平较模型组明显降低(P＜0.05)，说明复方甘草酸苷能够抑制结肠组织COX-2的表达, 从而起到抑制炎症, 修复溃疡的作用。COX-2启动子含有NF-κB的结合位点[11], 故NF-κB亦能够对COX-2的表达起调控作用，因此，NF-κB在UC的病理生理过程中可能起枢纽作用，而NF-κB p65是NF-κB家族5个成员之一, 是炎症性肠病中最重要的促炎单位[12]。

本研究发现大鼠实验性UC模型中NF-κB p65、COX-2的表达明显增高，通过药物干预发现，复方甘草酸苷治疗组中NF-κB p65、COX-2的表达水平较模型组明显降低(P＜0.05)，说明复方甘草酸苷能够抑制结肠组织NF-κB、COX-2的表达，从而起到抑制炎症, 修复溃疡的作用, NF-κB信号途径调控许多靶基因的转录表达，包含复杂的靶效应，COX-2 基因只是NF-κB的下游基因之一，故推测其治疗UC的作用机制可能是通过抑制NF-κB的活化, 抑制了NF-κB与DNA结合, 进而进一步降低了炎症因子及COX-2的表达, 从而起到抑制炎症反应及调节免疫，在肠黏膜局部通过抑制可以增强COX-2表达的转录因子, 或者减少炎症因子对COX-2的刺激作用, 从而减少COX-2的表达, 进而减少前列腺素类炎症介质的产生, 缓解肠道病变。

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Effect of Compound Glycyrrhizin on Expressions of Colonic NF-κB p65 and COX-2 in Ulcerative Colitis Rats

LU Guang-xin1, LV Fei1, DU Yong1, YANG Yang-guo1, ZHOU Chun-fang1, JIN ling-li1, YANG Jian-ye2
(1. Department of Gastroenterology, 2. Clinical Research Institute,Renmin Hospital, Hubei University of Medicine, Shiyan 442000, China)

ObjectiveTo investigate the experimental therapeutic effect of the Compound Glycyrrhizin on the expression of NF-κB p65 and COX-2 in rats with ulcerative colitis(UC) induced by trinitrobenzene sulfonic acid/ethanol (TNBS/ethanol).MethodsForty adult Sprague-Dawley rats were randomly divided into 4 groups(n=10), Normal control group received no treatment, while the rest groups used trinitrobenzene sulfonic acid/ethanol enema to generate ulcerative colitis models. UC model group received saline water enema and decapitated three days later, Compound glycyrrhizin glycosides treatment group daily received glycyrrhizin glycosides solution enema, 40 mg·kg-1·d-1, Continuous enema 7 days and decapitated,, Sulfasalazine (SASP) treatment group daily received SASP solution enema,0.5 g·kg-1·d-1, Continuous enema 7 days and decapitated, Each group received different treatment as described above, NF-κB p65 and COX-2 were detected by immunohistochemistry.ResultsCompared with Normal control group, the level of NF-κB p65 was significantly increased in UC model group、SASP treatment group and Compound glycyrrhizin glycosides treatment group [0.25±0.11 vs 5.58±0.85 vs 3.36±0.66 vs 3.21±0.58, P＜0.01], and the level of COX-2 was significantly increased [0.21±0.13 vs 5.54±0.40 vs 3.23±1.05 vs 3.16±0.94, P＜0.01]. Compared with Model group, the level of NF-ęB p65 was significantly decreased in SASP treatment group and Compound glycyrrhizin glycosides treatment group [5.58±0.85 vs 3.36±0.66 vs 3.21±0.58, P＜0.01], and the level of COX-2 was significantly decreased [5.54±0.40 vs 3.23±1.05 vs 3.16±0.94, P＜0.01].ConclusionCompound Glycyrrhizin has therapeutic effect on ulcerative colitis in rat. The mechanism is associated with the reduced levels of NF-κB p65 and COX-2.

Ulcerative colitis; Rats; Trinitrobenzenesulfonic acid/ethanol; Compound Glycyrrhizin;NF-κB p65; COX-2

R574.62 Q95-33

A

1674-5817(2014)02-0098-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2014.02.004

2013-08-14

湖北省教育厅科学技术研究计划指导性项目(B类: 10026122)

卢光新(1969-), 男, 硕士, 主任医师, 研究方向: 中西医结合治疗消化系统疾病,E-mail: sylgx1325@sina.com

吕 飞(1983-), 男, 硕士, 住院医师, 研究方向: 中西医结合治疗消化系统疾病,E-mail: 276699533@qq.com