慢性束缚应激诱导自发性高血压大鼠出现抑郁焦虑样行为

曹 爽, 丁建伟 , 李 炳, 袁丽粉, 杜 勤

(1. 上海交通大学医学院附属第九人民医院, 上海 200011;2. 云南中医学院针灸推拿康复学院, 昆明 650500;3. 复旦大学附属金山医院, 上海 201508)

慢性束缚应激诱导自发性高血压大鼠出现抑郁焦虑样行为

曹 爽1, 丁建伟2, 李 炳3, 袁丽粉1, 杜 勤1

(1. 上海交通大学医学院附属第九人民医院, 上海 200011;2. 云南中医学院针灸推拿康复学院, 昆明 650500;3. 复旦大学附属金山医院, 上海 201508)

目的 探讨自发性高血压大鼠(SHR)在慢性束缚应激(Chronic Restraint Stress, CRS)时抑郁焦虑样行为学改变。 方法 雄性SHR大鼠16只，随机分为对照组(CON, n=8)和慢性束缚应激组(CRS, n=8)。通过旷场试验(Open Field test, OFT)、强迫游泳实验(Forced Swimming test, FST)、高架十字迷宫试验(Elevated Plus Maze, EPM)评价其抑郁焦虑样行为，同时比较SHR血压变化及血清ACTH水平。结果 束缚4周后，与对照组相比，CRS组的SHR在OFT中直立次数及总位移均显著降低(P＜0.05)，FST中不动时间显著延长(P＜0.05)，EPM中开臂滞留时间百分比显著下降(P＜0.05)。 结论 慢性束缚应激可诱导SHR出现抑郁焦虑样行为。

自发性高血压大鼠(SHR); 慢性束缚应激(CRS); 抑郁; 焦虑

高血压病是临床常见的身心疾病，其中焦虑抑郁障碍是高血压患者中最常见的情绪障碍[1]。焦虑抑郁障碍不仅是高血压病的独立危险因素，还可显著影响高血压患者的预后[2～3]。应激是高血压与焦虑抑郁相互联系的因素之一[4]。遇到应激事件时，高血压人群与正常血压人群相比，心率及血压的升高幅度更大，更易激惹，更易出现焦虑抑郁情绪，这与高血压患者体内交感神经活性增高及下丘脑-垂体-肾上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal axis, HPA)轴的高反应性有关。SHR是目前国际公认的最接近于人类原发性高血压动物模型，其发病机制、外周血管阻力变化等都与人类高血压相似。同时SHR属于应激高反应性动物，应激时其相关神经内分泌及心血管功能变化均较正常血压大鼠更为显著[5～6]。而应激尤其是慢性应激除包括神经内分泌等生理反应外，还伴随着一系列情绪、行为等心理反应。因此关于慢性应激对自发性高血压大鼠的行为学影响日益受到关注，高血压伴发抑郁焦虑动物模型的制备也成为研究的热点。本实验拟对SHR施予慢性束缚应激，观察其抑郁焦虑样行为及血压、内分泌相关激素水平变化，以期为高血压伴发抑郁焦虑动物模型的制备提供参考，为深入研究高血压伴发抑郁焦虑的相关机制提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物与饲养环境

10周龄清洁级雄性SHR大鼠，由北京维通利华实验动物技术有限公司[SCXK(京)2012-0001]提供，实验在上海市公共卫生临床中心[SYXK(沪)2010-0098]进行。大鼠饲养环境温度为22±2 ℃，相对湿度55%±15%，维持12 h昼夜节律(光照时间7∶00～19∶00)。大鼠在适应性饲养一周后开始正式实验。本研究动物实验遵守美国国立卫生院倡导的实验动物管理和使用指导原则(Guide for Care and Use of laboratory Animals, NIH)，并经上海交通大学动物伦理委员会批准[沪科动伦(2012)30]。

1.2 主要仪器与试剂

旷场实验、高架十字迷宫实验设备及小动物行为分析系统均由上海多毅信息科技有限公司提供。PowerLab ML125/R 无创尾动脉血压测定分析系统由上海交通大学医学院生理教研室提供。ACTH放免试剂盒购自北京北方生物技术研究所。

1.3 慢性束缚应激

将16只SHR随机分为2组: 对照组(CON，n=8)和慢性束缚应激组(CRS，n=8)。CRS组参照文献方法[7～9]，将大鼠束缚于束缚架上，限制大鼠自由活动，但不会对其造成伤害。大鼠每日束缚6 h(9∶00～15∶00)，连续4周。

1.4 旷场实验(OFT)

旷场实验在底面为100 cm×100 cm, 高40 cm的无盖黑色方箱中进行，并由数码摄像头监测动物行为活动。实验时将大鼠放入箱内底面中心, 同时进行摄像，由小动物行为分析系统记录分析5 min内大鼠的水平运动情况及直立次数。实验人员和计算机等设备与旷场箱隔开以减少对动物的干扰。

1.5 强迫游泳实验(FST)

实验第1日将每只大鼠单独放入玻璃圆筒中(桶高40 cm，直径18 cm)，预游泳15 min。第2日，再次将测试大鼠放入桶中，记录大鼠在5 min内的不动时间。

1.6 高架十字迷宫实验(EPM)

实验装置由两条开臂(长50 cm，宽10 cm)和两条闭臂(长50 cm, 宽10 cm, 高20 cm)连接而成，且距离地面50 cm，并由数码摄像头监测动物行为活动。测试时将大鼠面对开臂置于EPM的中央平台处，由小动物行为分析系统记录分析5 min内大鼠在开、闭臂中的活动情况，以开臂滞留时间百分比为评价指标。实验在安静、四周由遮光帘隔离干扰的环境条件下进行。

1.7 血压测定

将大鼠置于无创尾动脉血压测定分析系统(PowerLab)配备的大鼠固定器内，并将鼠尾在37℃恒温水浸泡，待局部血管充分扩张后，将气囊式尾套及脉搏传感器依次套于鼠尾，然后观测脉搏波形，出现稳定的脉搏波时开始测定血压。重复测量3次，取平均值。

1.8 血浆ACTH浓度测定

行为学实验及血压测定完成后，10%水合氯醛腹腔注射(0.4 ml/100 g)麻醉大鼠，然后经心脏取血，离心后取血浆，用放射免疫法测定血浆中ACTH浓度。

1.9 统计学处理

采用SPSS 19.0软件统计处理，数据以x- ± s表示, 两组比较用t检验, P＜0.05为统计学显著差异。

2 结果

2.1 OFT

如表1所示，旷场实验中，与CON组大鼠相比，CRS组大鼠直立次数及总位移出现显著下降，且每周测试结果比较均具有显著性差异(P＜0.05)。

2.2 FST

如表2所示, CRS组大鼠在束缚后第2周到第4周在FST中的不动时间, 较CON组显著延长(P＜0.05),表现出抑郁样行为。

表 1 慢性束缚应激后SHR旷场行为变化Table 1 Behvavior in OFT after CRS

2.3 EPM

自束缚第2周起，CRS组大鼠开臂滞留时间百分比与CON组比较出现显著下降(P＜0.05)(表3)。

2.4 血压

在束缚期间，CRS组大鼠血压呈持续升高趋势，与CON组大鼠血压相比差异具有统计学意义(P＜0.05)(表 4)。

2.5 血浆ACTH浓度

束缚4周后，CRS组大鼠的血浆ACTH浓度(72.01±5.76) pg/ml显著高于CON组大鼠(50.26±3.27)pg/ml(P＜0.05)。

3 讨论

慢性束缚应激是一种是有效的负性心理应激动物模型, 其通过剥夺动物活动自由而产生纯粹的挫折应激，激活交感神经系统及HPA轴(hypothalamicpituitary-adrenal axis)，进而影响动物行为。大量研究已报道慢性束缚应激可以诱导大鼠出现了稳定的抑郁焦虑样行为。其具体机制可能与海马糖皮质激素受体下调，脑内脑源性神经生长因子(brainderived neurotrophic factor, BDNF)及其受体功能受损，促炎因子IL-6水平升高及抑炎因子IL-10水平降低，进而导致海马、杏仁核等部位神经元结构功能改变等有关[9～11]。

OFT是评价大鼠在陌生环境中自发行为、探究行为与紧张度的一种方法，大鼠在旷场中的总位移及直立次数反映其自发活动及对新异环境的好奇心。FST是通过大鼠在水中不动时间反映其绝望行为。EPM则是利用大鼠对新异环境的探究特性和对高悬敞开臂的恐惧形成矛盾冲突行为来考察动物的焦虑状态，其中大鼠在开臂中的滞留时间与焦虑水平成反比。本实验发现连续4周的慢性束缚应激后，SHR大鼠在OFT中规定时间内总路程及直立次数均明显减少，说明其活动性下降，好奇心减低; 在FST中挣扎及攀爬行为减少，不动时间延长，反映其绝望程度增加。这些表现说明应激后SHR呈现抑郁状态，与抑郁症临床中精神运动改变、兴趣减低及无助、自杀等行为有一定的相似性。同时，应激组大鼠在EPM开臂探索次数及停留时间明显降低，又表现出一定的焦虑情感。目前，关于应激时SHR大鼠行为学改变的研究并不很多。其中Roman等[12]发现在SHR在急性应激时可表现出典型的焦虑样行为，而慢性应激并未显著影响其焦虑水平。与本实验结果不符，推测可能与应激的方式及持续时间不同有关，本实验中采用的慢性束缚应激所导致的心理应激相对更为强烈。

表 2 慢性束缚应激对SHR强迫游泳实验中不动时间的影响Table 2 Alterations in immobility behavior in the FST after CRS

表 3 慢性束缚应激对SHR高架十字迷宫实验中开臂滞留时间百分比的影响Table 3 Effect of CRS on the time spent in open arms of SHR in EPM

表 4 慢性束缚应激对 SHR血压的影响Table 4 Effect of CRS on blood pressure of SHR

同时，HPA轴及蓝斑-交感-肾上腺髓质轴激活是应激反应的主要特征。本实验中经过慢性束缚应激的SHR变现出血浆ACTH水平和收缩压显著升高。已有大量研究表明SHR是应激高敏动物，在应激时其神经内分泌及心血管系统相关指标均较正常血压大鼠显著[5～6]。本实验结论与之相吻合。

综上所述，慢性束缚应激使SHR血浆ACTH及收缩压升高的同时，也诱导其抑郁焦虑样行为的发生。SHR应激后情感反应一方面可能与血浆ACTH水平升高有关，另一方面可能与其血压水平有关。其中血压及焦虑抑郁情绪关系密切，二者有着众多调控机制，如HPA轴紊乱、交感神经活性异常及脑内肾素-血管紧张素系统功能改变，中枢神经递质和神经肽类(5-羟色胺、缩宫素及加压素等)的合成与释放异常，脑内慢性非特异性炎症反应的激活等[4]。因此SHR大鼠血压水平的增高，可能使其在应激时更易表现出抑郁焦虑障碍样行为，而这些负性情感反应反过来又可干扰血压的调控，使血压进一步升高。

临床中高血压伴发抑郁焦虑障碍在临床中越来越常见，二者共病机制研究尚需进一步研究。鉴于直接进行人体实验的局限性，制备合适的动物模型显得尤为重要。目前采用复合处理，制备在一种疾病基础上伴发抑郁的动物模型已有较多报道，如卒中后抑郁及心梗后抑郁动物模型均多可是采用慢性应激的方法来制备[13～14]，而高血压伴发抑郁焦虑动物模型的建立报道尚少。本研究由慢性束缚应激诱导SHR出现焦虑抑郁样行为，使之同时具备了高血压及抑郁焦虑的特性，与临床中二者高血压与抑郁焦虑共病的特征点十分相近，可由此做进一步探索，使之为高血压伴发抑郁焦虑的病理机制的深入研究创造条件。

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Chronic Restraint Stress Induced Anxiety- and Depression-like Behaviors in Spontaneously Hypertensive Rats

CAO Shuang1, DING Jian-wei2, LI Bing3, YUAN Li-fen1, DU Qin1
(1. Shanghai Ninth People’s Hospital Affiliated Shanghai Jiao Tong University School of Medicine,Shanghai 20001, China; 2. School of Acupuncture, Massage and Rehabilitation, Yunnan College of Traditional Chinese Medicine, Kunming 650500, China;3. Affiliated Jinshan Hospital, Fudan University, Shanghai 201508, China)

ObjectiveTo investigate the effects of chronic restraint stress (CRS) on anxiety- and depression-like behaviors in Spontaneously Hypertensive Rats(SHR).MethodsSHR were randomly divided into control(CON) group and CRS group respectively. The changes of behaviors were detected by open field test (OFT),forced swimming test (FST) and elevated plus maze(EPM) testŁ¬the changes of blood pressure and levels of adrenocorticotropic hormone(ACTH) in plasma in different groups were also measured and compared.ResultsSHR in CRS group showed significant reductions in rearing incidence in OFT(PŁĽ0.05),the time spent in open arms during the EPM(PŁĽ0.05), and the immobility during the FST was increased significantly (PŁĽ0.05). Furthermore, the blood pressure and concentration of plasma ACTH increased significantly in CRS group compared to CON group.ConclusionsCRS can induce anxiety- and depression-like behaviors in SHR.

Spontaneously Hypertensive Rat(SHR);Chronic Restraint Stress(CRS); Depression; Anxiety

Q95-33

A

1674-5817(2014)02-0093-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2014.02.003

2013-10-12

上海市科委资助项目(074119621)

曹 爽(1988-), 女, 硕士研究生, 从事老年高血压与抑郁症的研究。E-mail: caoshuang2209@163.com

杜 勤(1964-), 硕士生导师, 从事老年心血疾病与心理障碍等的研究和治疗。E-mail: jeanniedu@hotmail.com