应用沉淀法消除HLAP患者生化标本乳糜状态的探讨

2014-01-02张辉亮黄树华刘健玲夏厚才

检验医学 2014年9期

张辉亮，黄树华，刘健玲，夏厚才

(广州市南沙区第六人民医院检验科，广东广州511470)

高脂血症是导致高脂血症性急性胰腺炎(hyperlipidemic acute pancreatitis，HLAP)的病因之一，但同时高脂血症也是HLAP代谢异常的表现[1-2]。HLAP患者由于胰腺功能受损，脂肪代谢障碍，在发病期间血脂急剧升高，极大地加重了血液中脂肪的含量[3]，使患者血清外观呈牛奶样极度浑浊状态，即通常所说的重度乳糜血，极大地干扰了生化检验的比色和比浊法测定，在生化分析仪上显示“ABS(吸光度异常)”报警信息或者甚至为负值，无法完成项目的测试。平时遇到此类重度乳糜标本一般都以“标本不合格”的理由退回或者建议素食若干天后重抽血。但HLAP患者标本不同于普通的高脂血症标本。急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是一种急腹症，病情危急，严重者甚至会休克或死亡[4]，临床上迫切需要掌握相关的检验项目数据以便能及时进行诊治。针对这种情况，我们以磷钨酸镁作为去除血脂的沉淀剂，探索和确立了一套能消除HLAP患者标本乳糜状态并准确进行主要生化项目检测的可靠方法。

材料和方法

一、材料

1.标本来源实验所用标本均来自广州市南沙区第六人民医院门诊或住院患者生化检验标本。外观正常的标本即肉眼观察非溶血、非黄疸和非脂血的标本。37例 HLAP患者标本来自2011年10月至2013年6月经广州市南沙区第六人民医院确诊的HLAP患者。HLAP诊断标准参照“中国急性胰腺炎诊治指南”标准[5]:具备AP的临床表现和生化改变，且Ranson评分≥3;CT分级 D或 E;APACHEⅡ评分≥8;甘油三酯(triglyceride，TG)＞11.3 mmol/L 或 TG 为 5.65～11.3 mmol/L且血清呈乳状;排除AP的其他致病因素如胆道结石、微结石、Oddi括约肌功能障碍、药物性AP、细菌病毒感染等。

2.检验项目项目为除血脂外的常规生化检验项目，包括钾离子(K+)、钠离子(Na+)、氯离子(Cl-)、钙离子(Ca2+)、二氧化碳结合力(CO2combining power，CO2CP)、血糖(glucose，Glu)、尿素(Urea)、尿酸(uric acid，UA)、肌酐(creatinine，Cr)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂 C(cystatin C，Cys C)、淀粉酶(amylase，AMY)、丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)、γ-谷氨酰基转移酶(gamma-glutamyltranspeptidase，GGT)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、胆碱酯酶(cholinesterase，CHE)、总蛋白(total protein，TP)、白蛋白(albumin，Alb)、总胆红素(totalbilirubin，TBil)、直接胆红素 (direct bilirubin，DBil)、总胆汁酸(total bile acid，TBA)、肌酸激酶(creatine kinase，CK)、肌酸激酶同工酶MB(creatine kinase-MB，CK-MB)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LD)、乳酸脱氢酶同工酶1(lactate dehydrogenase 1，LD-1)、α-羟丁酸脱氢酶(alpha-hydroxybutyrate dehydrogenase，α-HBDH)、高敏C反应蛋白(high-sensitive C reactive protein，hs-CRP)。

3.仪器与试剂仪器为TOSHIBA-120FR全自动生化分析仪。K+、Na+、Cl-试剂由日本东芝株式会社生产;Ca2+、Glu、Urea、UA、ALT、AST、GGT、ALP、TP、Alb、TBil、DBil、CK、LD、α-HBDH、CK-MB试剂由中生北控生物科技股份有限公司生产;Cr、TBA、CO2CP、LD-1试剂由日本积水化学工业株式会社生产;AMY、CHE试剂由北京利德曼生化股份有限公司生产;Cys C、hs-CRP试剂由英国RANDOX实验诊断有限公司生产。脂肪乳液为广州百特侨光医疗用品有限公司生产的中/长链脂肪乳注射液(C8-24)。沉淀剂磷钨酸镁为中生北控生物科技股份有限公司生产的沉淀法高密度脂蛋白胆固醇试剂盒配套的沉淀剂。质控品为RANDOX复合质控品level-2和level-3，批号分别为741UN和539UE。

二、方法

1.相关性分析取外观正常的临床标本血清20支，以1∶1的比例与磷钨酸镁试剂混合，静置5 min后以2 600×g离心10 min，对上清液进行上述常规生化项目检测，将测量数值乘以稀释倍数2作为最终结果;同时此20支临床标本血清原液亦进行相同的生化项目检测。对各生化项目两组数据进行相关性分析，得出散点图、拟合曲线图及相关系数、判定系数、回归方程等参数。

2.回收试验用脂肪乳液与蒸馏水混合配制成TG含量大约为20、80、160 mmol/L的低、中、高3个浓度的乳液备用。取外观正常的临床标本血清20支做上述常规生化项目检测，然后每支血清取3份分别与配制好的乳液等比例混合，模拟成轻、中、重3种不同程度的乳糜血清(TG最终浓度分别为10、40、80 mmol/L)，再与磷钨酸镁试剂1∶1混合，其余操作同上，对上清液或下清液进行相同生化项目检测，将测量数值经回归方程转换，再乘以相应的稀释倍数作为最终结果，与原始结果进行比较，计算各生化项目的回收率。

3.HLAP患者标本实证试验 HLAP患者标本首先用稀释法测定TG浓度，再根据TG浓度作适当处理后与磷钨酸镁试剂1∶1混合，其余操作步骤同上。

三、统计学方法

用EXCEL2007表格处理初始数据并进行均值、回收率的计算;用SPSS 18.0软件Regression(回归)菜单下的 Curve Estimation(曲线估计)和Linear(线性)2个功能进行相关性分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

一、相关性分析

经磷钨酸镁试剂处理后的血清标本能正确检测的生化项目有 K+、Na+、Cl-、Ca2+、Glu、Urea、UA、Cr、AMY、ALT、AST、GGT、ALP、CHE、TP、Alb、TBA、CK、LD、α-HBDH;不能正确检测，即测定结果等于零、趋于零或负值的生化项目有 CO2CP、TBil、DBil、CK-MB、LD-1、Cys C、hs-CRP。

散点图及拟合曲线图以K+作为代表，见图1。拟合曲线图除了 Na+、Cl-、Ca2+在坐标轴上有较明显的截距外，其余项目曲线均通过原点或近似通过原点。

能正确检测的生化项目回归系数b除Na+、Cl-外其余均趋于“1”;相关系数(r)除 Na+、Cl-、Ca2+外其余均＞0.99，Na+、Cl-、Ca2+的 r＞0.90;判定系数(R2)除 Na+、Cl-、Ca2+外其余均＞0.98，Na+、Cl-、Ca2+的 R2＞0.80;拟合曲线显著性检验P均＜0.01。见表1。

图1 K+经磷钨酸镁处理前、后检测值的拟合曲线图

二、回收试验

轻、中、重3组模拟乳糜血清标本经磷钨酸镁处理后其中轻度乳液析出物沉淀，上清液澄清;中度和重度乳液析出物上浮，下清液澄清。各生化项目的平均回收率最低为 98.03%，最高为103.44%，均在95% ～105%之间。见表2。

表2 3组模拟乳糜血清标本经磷钨酸镁处理后各生化项目的回收率(n=20)

三、HLAP患者标本实证试验

37例HLAP患者标本中TG＜10 mmol/L有3例、10～40 mmol/L有26例、＞40 mmol/L有8例(其中有2例超过了100 mmol/L)。乳糜去除效果:TG＜10 mmol/L的标本与磷钨酸镁混合后沉淀效果显著，上清液清澈透明。TG＞40 mmol/L的标本析出物不沉淀反而上浮，下清液亦清澈透明。TG为10～40 mmol/L的标本析出物部分沉淀或上浮，上清液浑浊，乳糜去除效果不甚理想。若先作适当的倍比稀释，使TG＜10 mmol/L再与磷钨酸镁等比例混合即可达到完全沉淀的效果。见表3。37例HLAP患者标本经过磷钨酸镁处理后取上清液或下清液进行生化项目检测。能顺利检测的生化项目包括K+、Na+、Cl-、Ca2+、Glu、Urea、UA、Cr、AMY、ALT、AST、GGT、ALP、CHE、TP、Alb、TBA、CK、LD、α-HBDH;无法检测的生化项目有 CO2CP、TBil、DBil、CK-MB、LD-1、Cys C、hs-CRP。磷钨酸镁对生化项目检测的影响与相关性分析试验中的影响是一致的。

表3 37例HLAP患者标本实证试验乳糜去除效果

讨论

HLAP多见于Ⅰ、Ⅳ和Ⅴ型高脂血症患者，上述型别脂血症患者标本的特点是血清中悬浮着大量影响浊度的乳糜微粒和极低密度脂蛋白(very low-density lipoprotein，VLDL)。乳糜微粒和VLDL均含有丰富的TG。因此，临床上把TG浓度作为HLAP的诊断依据[1，5-7]。本研究结果显示大多数HLAP患者的TG浓度为10～40 mmol/L，个别甚至超过了100 mmol/L，TG浓度往往比普通高脂血症患者或餐后一过性高血脂患者高出十几倍甚至几十倍。如此浑浊的乳糜标本对以透射光为主要检测原理的生化检验造成了极大的影响[8]，常用的消除本底干扰的稀释法与双试剂两点法只适用于轻度的脂血标本[9-10]，并不能消除HLAP患者标本重度乳糜所带来的干扰。

很多文献报道了各种去除血脂的方法，如4℃冰箱过夜法、超速离心法、乙醚抽提法、聚乙二醇沉淀法、磷钨酸镁沉淀法等。4℃冰箱过夜法操作简单，但不能彻底消除乳糜的干扰，且检验时间过长，不适用于HLAP急诊检验，标本长时间存放也会导致检验结果不准确;超速离心法对生化反应影响最小，能去除大部分乳糜，但不彻底[11]，且超速离心会使部分血清成分特别是大分子物质(如蛋白质等)分布不均匀而影响结果的准确性，另外超速离心机常见于科研机构，一般医院很少配备，限制了其使用;乙醚抽提法易使蛋白质酶类发生变性，影响蛋白质和酶类的检测[12]，且乙醚具有易燃、易爆、易挥发和神经麻醉的特性，对环境及操作人员会构成一定的安全隐患;聚乙二醇结构复杂，从 PEG-200到 PEG-20000不等，沉淀效果千差万别，且对于高脂血症标本，其重复性较差，另外还会随着加入浓度的不同而影响不同的试验[13];磷钨酸镁沉淀法虽然也会影响部分试验的检测，但其清除血脂彻底，产物结构稳定，是中华医学会检验分会作为沉淀法检测高密度脂蛋白胆固醇(high-densitylipoprotein cholesterol，HDL-C)推荐使用的理想沉淀试剂[14]。

磷钨酸镁作为沉淀剂检测HDL-C的原理为多聚阴离子与二价金属离子共同作用，与血清中的载脂蛋白B(apolipoprotein B，apo B)形成不溶性的复合物。因此，磷钨酸镁可选择性沉淀含apo B的乳糜微粒、VLDL、低密度脂蛋白(lowdensity lipoprotein，LDL)和脂蛋白(a)[lipoprotein(a)，Lp(a)]，前者含 apo B48，后三者含 apo B100，血清脂蛋白中仅剩余不含apo B的高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)即可单独检测[15]。本研究的实验设计正是利用磷钨酸镁能够沉淀去除乳糜微粒和VLDL的原理而达到消除血清乳糜状态的目的。

通过对外观正常的标本经磷钨酸镁处理前后常规生化检验项目的分析显示，除了CO2CP、胆红素、同工酶类、血脂类和比浊法的试验外，绝大多数的生化项目经磷钨酸镁处理后均可正确检测，且与处理前有非常好的相关性，拟合曲线分析显示两者呈显著的直线相关，利用直线回归方程可建立它们之间的关系。从各生化项目的散点图和拟合曲线图上可看出，拟合曲线图除了Na+、Cl-、Ca2+在坐标轴上有较明显的截距外，其余项目曲线均通过原点或近似通过原点。另外，除了Na+、Cl-外其余项目回归方程的回归系数均趋于“1”。因此，在实际应用中，除了 Na+、Cl-、Ca2+之外，其他项目的回归方程可近似地把截距看作是“0”而把回归系数看作是“1”，这样方程就可以简化成“Y=X”，也就是标本经磷钨酸镁处理后以上这些检测结果只需乘以稀释倍数即可，磷钨酸镁对这些生化反应不会产生干扰。当然，如果各实验室能制订出适合本实验室使用的回归方程，通过方程计算出最终结果会更加准确、可靠。

由于外观正常标本与乳糜状态标本存在着较大的差异，磷钨酸镁在乳糜状态下对生化检验项目的干扰不一定与外观正常标本相同，因此本研究设计了轻、中、重3类模拟乳糜血清标本并对其做各项目的回收试验。结果显示，相关性分析试验中具有直线相关的所有生化项目其回收试验数据经回归方程转换后回收率均介于95%～105%之间，具有良好的回收效果，无论标本是否为乳糜状态，磷钨酸镁对生化项目检测的干扰是恒定的。

模拟乳糜血清由于加入的脂肪乳液成分单一，仅含中长链的TG，不含胆固醇，与真正的乳糜标本有一定的差别。为了证实磷钨酸镁对真正HLAP患者标本的处理效果，本研究收集了37例HLAP患者血清标本做实证试验。结果显示磷钨酸镁沉淀血脂的最适范围为 TG＜10 mmol/L。TG＞40 mmol/L的标本的析出物反而上浮(回收试验中中度和重度乳液血清析出物也上浮)，可能是由于此类标本血脂绝大部分的成分为TG所致;而TG浓度为10～40 mmol/L之间的标本血脂成分相对复杂，且含量又超出了磷钨酸镁的沉淀能力，因此需做一定的倍比稀释，使 TG＜10 mmol/L后才能彻底清除血脂。从实证试验可得出TG＜10 mmol/L和TG＞40 mmol/L的标本与磷钨酸镁溶液等比例混合离心，前者取上清液、后者取下清液可以进行常规生化项目的检测;TG在10～40 mmol/L之间的标本先做倍比稀释，使TG＜10 mmol/L后再与磷钨酸镁溶液等比例混合离心，取上清液进行检测。原液无法检验的HLAP患者标本经磷钨酸镁处理后能正确进行绝大部分生化检测，受影响的项目与外观正常标本相关性分析试验中的一致。

综上所述，磷钨酸镁沉淀法能有效消除HLAP患者标本的严重乳糜状态，并对绝大多数的生化项目不会产生干扰，试验操作简单、快捷，沉淀效果显著，试剂来源便利，不需要任何特殊的设备，成本低廉，适合所有医院的实验室，是HLAP患者标本以及其他乳糜标本理想的生化检验前处理方法。

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