耐甲氧西林金黄色葡萄球菌医院感染爆发流行的实验室调查

徐伟红，徐 斌，范列英

(1.同济大学医学院，上海200092;2.上海同仁医院，上海200050;3.同济大学附属东方医院，上海200040)

医院感染爆发的定义是在短时间内发生3例以上同种同源感染病例的现象。对同种同源病例的定义，临床大多以细菌耐药菌谱作为同源性分析的依据，一直以来缺乏有效、实用、适用的实验室监测手段。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)耐药株感染率近年来快速上升，除了与抗菌药物的滥用有关，还与菌株的克隆传播有很大关系[1]。我们收集了上海同仁医院临床分离的38株MRSA，采用mecA基因相关高变区(mecA gene related hyper-variable region，HVR)多态性分析对其进行分型，了解其多态性分布状况，为医院感染爆发的确立提供实验室依据。

材料和方法

一、材料

1.标本来源 38株MRSA菌株均来源于2013年7月至2013年9月上海同仁医院的住院患者，非重复菌株。其中来自痰标本20株、咽拭子9株、尿液4、胆汁3株、脓液和导管各1株。

2.实验仪器及试剂 VITEK 2-COMPACT全自动微生物分析系统及其配套的GP67药敏板为法国梅里埃公司产品;血平板和MH平板购自上海伊华生物公司;细菌基因组DNA提取试剂盒购自上海之江生物公司;聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)试剂 Takara TaqTMHot Start Version购自宝生物工程(大连)有限公司;DNA Marker(100 bp ladder)购自北京TIANGEN生物技术有限公司;金黄色葡萄球菌 HVR-PCR引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成。Veriti 96-Well PCR扩增仪为ABI公司的产品;凝胶成像仪为TANON公司产品。

二、方法

1.细菌鉴定及药敏 所有菌株均经VITEK 2-COMPACT全自动微生物分析系统进行菌种鉴定及体外药敏分析。质控菌株为金黄色葡萄球菌ATCC25923和金黄色葡萄球菌ATCC29213。

2.细菌DNA的提取 严格按上海之江生物公司生产的细菌基因提取试剂盒说明书操作。

3.PCR引物 HVR引物序列根据文献[2]。引物序列:P1为5’-ACTATTCCCTCAGGCGTCC-3’，P2 为 5’-GGAGTTAATCTACGTCTCATC-3’。

4.MRSA的HVR-PCR分型 取MRSA的菌株基因组DNA 1μL作为扩增的模板，加入PCR反应体系:HVR-PCR引物0.2μL(引物浓度为10 mmol/L)，10×PCR buffer 1μL，2.5 mmol/L dNTP 0.8μL，Taq 聚合酶0.05μL，灭菌去离子水6.95μL，反应总体积为 10μL。PCR 反应条件:94℃预变性1 min;94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃30 s，35个循环;72℃延伸4 min。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后在凝胶成像系统中进行分析。

结 果

一、MRSA的HVR-PCR分型结果及HVR基因型的分布

MRSA的HVR-PCR产物经电泳后可观察到4种不同条带，见图1。根据这些条带的不同(PCR产物片段大小)，38株MRSA被分为A、B、C、D 种基因型，其中以 C型23株(60.53%)，A型7株(18.42%)、B 型3 株(7.89%)、D 型2 株(5.26%)、未分型 3 株(7.89%)。C 型在各临床科室均有分布，主要集中于老干部科。A、B、D和未分型则随机分布在各临床科室。见表1。

表1 MRSA的HVR基因型在各科的分布

图1 MRSA的HVR-PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳

二、MRSA的药敏结果

MRSA对苯唑西林、青霉素的耐药率为100%，对红霉素、环丙沙星、克林霉素、莫西沙星、四环素、左氧氟沙星的耐药率均在80%以上。对奎奴普汀/达福普汀、替加环素、万古霉素的敏感率为100%，对利福平的敏感率为89.5%，利奈唑烷的敏感率为81.6%。见表2。

表2 MRSA对常用抗菌药物的耐药情况

讨 论

由于MRSA抵抗力和毒力均较强，常存在多重耐药，伴随近年来分离率的增加，更被重视。在控制医院感染方面，MRSA已经成为主要的引起暴发流行的致病菌，因而寻找传染源、切断传播途径显得尤为重要[3]。

MRSA是指表达mecA基因或具有其它耐药机制如青霉素结合蛋白与苯唑西林的亲和力改变的金黄色葡萄球菌[4]。mecA基因是耐甲氧西林葡萄球菌特有的[5]，而HVR与该基因紧密相连，存在于其下游，也具有特异性。mec基因高变区的dru序列是位于mecA与IS431 mec之间、长约2 040 bp的片段，由一个40 bp的片段重复1～9次构成。在不同的MRSA菌株中dru重复次数不同，决定了MRSA基因的多态性，成为基因分型的分子基础。本研究根据HVR长度多态性将38株MRSA分为4型，其中以C型多见(60.53%)，A 型7 株(18.42%)、B 型 3株(7.89%)、D 型 2株(5.26%)、未分型 3 株。王敏等[6]报道，用HVR-PCR方法将 MRSA按大小分为200、410、470、510及 600 bp共 5型，其中以 510 bp(61.25%)及 600 bp(21.25%)多见。曹鸿霞等[7]将安徽地区部分医院分离的73株MRSA电泳后发现470～600 bp的3种基因型，以600 bp(58.8%)多见。说明MRSA的流行存在地区差异。本研究未发现200 bp的菌株，也可能是实验菌株较少的原因。同时本研究结果显示MRSA呈严重且多重耐药，对苯唑西林、青霉素的耐药率100%，对红霉素、环丙沙星、克林霉素、莫西沙星、四环素、左氧氟沙星的耐药率都在80%以上。故首选抗生素治疗药物为万古霉素、替加环素、奎奴普汀/达福普汀和替考拉宁。

MRSA主要通过接触传播，很容易在医院环境内流行，常可造成局部地区的爆发流行。因此本研究选择了3个月内分离的所有的MRSA菌株，结果发现A型分离出7株，在医院内呈散在分布;C型分离出23株，为本院MRSA流行株的优势型别，各科室流行株之间具有高度同源性，提示科室之间存在交叉感染现象，应引起高度重视。C型集中于干部病房，表明MRSA菌株在干部病房内存在克隆传播。这与干部病房特殊的住院时间、用药特点及环境的交叉感染有关[9]。

利用PCR技术对MRSA进行分型的常用方法有随机引物PCR、扩增片段长度多态性、特异功能集团基因的多态性等分型方法[10]。mecA基因HVR长度多态性分型属于特异功能集团基因的多态性分型方法，只适合于MRSA菌株。本研究发现mecA基因HVR长度多态性分型在分型率、分辨力及结果上都较为可靠，可以为控制金黄色葡萄球菌感染提供详实的流行病学资料，值得推广。在MRSA流行病学研究中，往往会把几种方法联合使用，对MRSA的流行病学分析往往会更加准确。

综上所述，医院应采取严格的院内感染控制措施，防止MRSA耐药株在医院不同病区内的转移。同时应积极开展简便、快速的MRSA分型检测，寻找感染来源，对阻断MRSA在医院内的爆发流行有重要的临床意义。

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[6]王 敏，李先平，李文娟，等.耐甲氧西林金黄色葡萄球菌高变区基因分型研究及其与耐药性的关系[J].中华微生物学和免疫学杂志，2009，29(2):108-112.

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