幽门螺杆菌生物膜形成与其耐药机制的相关性

胡玢婕，赵付菊，赵 虎

(复旦大学附属华东医院检验科，上海200040)

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)是一种螺旋形、微需氧的革兰阴性病原菌，其在人类胃表面黏膜上皮细胞和黏液层的长期定植是慢性活动性胃炎和消化性溃疡的主要发病原因，也是导致胃部恶性肿瘤以及黏膜相关性淋巴组织淋巴瘤(mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma，MALT)的重要危险因子[1]。流行病学研究显示，尽管幽门螺杆菌相关疾病的发病率为15%，但世界范围内一半以上的人口(在发展中国家高达80%)携带此菌[2]。幽门螺杆菌的难以根除和耐药性菌株的日益增多存在多种原因，其耐药性与其在感染部位形成生物膜(biofilm)的密切联系已引起了广泛关注。我们主要对幽门螺杆菌生物膜的结构和形成发展、其与耐药机制的相关性以及临床防治幽门螺杆菌持续难治性感染的研究进展做一综述分析。

一、细菌生物膜的一般性质

细菌生物膜是细菌在生长过程中为适应生存环境而吸附于惰性或活性材料表面形成的一种与浮游态细菌相对应的生长方式[3]。生物膜细菌与浮游态细菌最主要的差别在于菌体排列紧密并包裹在自身分泌的胞外多糖基质(extracellular polymeric substance，EPS)内。这种基质能够改变菌体的表面性质，从而促进菌体在活性表面初始的黏附，同时防止细菌的过度聚集。

生物膜的形成是细菌发育序列在相关基因严格调控下的表达过程，其生长周期包括最初的定植、不可逆的黏附、结构分化、发展成熟和解聚再定植5个阶段[4]。在含有同种细菌的生物膜内，表层菌容易获得营养和氧气并排出代谢产物，具有旺盛的生命活动，而接近基质的深层菌则处于缓慢生长或不生长的休眠静止状态。细菌之间能够通过菌体产物来实现信息传递，包括细菌素、高丝氨酸内酯、分泌蛋白等代谢产物和部分遗传物质在内的信号分子能够改变生物膜内的种群分布，改变相邻细胞蛋白的表达，将某些遗传特性(如耐药性)传递给邻近细胞。因此，细菌生物膜并不是简单被动的表面黏附和细胞聚集，而是一种由基因组和环境互相影响决定的具有结构性、协调性和功能性的动态生物系统。

细菌生物膜的特性决定了其强大的环境适应能力。具有生物膜形成能力的细菌引起的机体持续性炎症反应和组织损伤被认为是慢性感染形成或恶化的原因[5];同时，这种由生物膜细菌引起的感染可抵抗宿主自身防御系统的免疫效应，并且对抗菌药物表现出逐渐增高的耐受能力[6]。

二、幽门螺杆菌生物膜的形成与发展

(一)幽门螺杆菌生物膜的组成成分

在Marshall和Warren首次成功培养和分离幽门螺杆菌[7]15 年后，Stark 等[8]观察到幽门螺杆菌NCTC11637(ATCC43504)菌株在玻璃发酵瓶中生长时在气液界面产生了一层不溶于水(含多糖)的被膜结构，证实了幽门螺杆菌同样具有形成生物膜的能力。而在近期的一项研究中，研究人员对从消化道溃疡患者分离的幽门螺杆菌TK1402株生物膜的扫描电镜结果显示，生物膜是细胞-细胞直接接触聚集形成多分层结构的前体[9]。这种性质与具有典型生物膜结构的铜绿假单胞菌生长方式相似，同时也观察到幽门螺杆菌生物膜中含有与铜绿假单胞菌生物膜基质中外膜囊泡(outer membrane vesicle，OMV)产物相类似的成分。

1.幽门螺杆菌生物膜中的蛋白质成分Yonezawa等[10]培养了8株不同的幽门螺杆菌，并提取其生物膜结构、分离OMV，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE)条带显示了一种22 000蛋白的存在，这种蛋白在OMV培养的第2天才开始出现，且仅出现在TK1402株的SDS-PAGE条带中。与此同时，他们测定了这种蛋白的N端氨基酸序列，测序结果显示其N末端5个氨基酸残基序列为[VDFSK]，但对于该蛋白鉴定、分离纯化和化学性质分析的工作成果仍未见报道。另外，研究人员也发现OMV存在于细菌和基质的交界面以及生物膜胞外间隙，推测OMV在幽门螺杆菌生物膜基质的产生和其黏附于细胞表面的最初阶段发挥了重要作用。

Yang等[11]选择了幽门螺杆菌(ATCC 43504)进一步研究幽门螺杆菌生物膜的蛋白组成。该研究构建了生物膜部分蛋白质上调的缺失突变模型并对其特征进行描述，同时利用气相色谱-质谱联用(gas chromatograph-mass spectrometer-computer，GC-MS)和核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)分析萃取的胞外多糖;结果显示一种1，4-甘露糖蛋白聚糖参与了生物膜的形成过程，而生物膜中粒细胞活化蛋白A(neutrophil-activating protein A，NapA)上调现象的存在使幽门螺杆菌表现出细胞聚集结构的减少和生物膜黏附能力的增强。

2.幽门螺杆菌生物膜中的糖类成分 检测连续培养的幽门螺杆菌生物膜材料产物的实验结果显示，胞外多糖的产物具有很高的碳/氮比例[8]。粗提取幽门螺杆菌进行碳水化合物分析，C14和C16脂类、N-乙酰氨基葡萄糖、海藻糖、葡萄糖、半乳糖和甘油酸甘露庚糖等幽门螺杆菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)的组成成分普遍存在。而另一项实验表明，幽门螺杆菌在释放OMV的同时，也会释放空泡毒素(vacuolating cytotoxin，VacA)、脲酶、LPS和其他外膜蛋白于OMV表面，证实了幽门螺杆菌生物膜是蛋白质和碳水化合物相互依赖的复合基质，为细菌在胃外环境中的生存提供了“保护性港湾”[11]。

3.幽门螺杆菌生物膜中的遗传物质 与大多数细菌生物膜含有遗传物质成分相似，幽门螺杆菌生物膜中也存在一定数量的胞外DNA(extracellular DNA，eDNA)。Grande 等[12]利用DNA印迹法和随机扩增多态性DNA聚合酶链反应(random amplification of polymorphic DNA-PCR，RAPD-PCR)分析培养2 d的幽门螺杆菌生物膜基质，首次发现了长度为 9 416 bp的 eDNA，而eDNA与胞内DNA具有不同的分子结构，表明eDNA释放的最初来源并不是细胞溶解;另外他们在培养基中加入DNase I，但DNase I对生物膜的生长成熟并没有显著影响。因此eDNA不是幽门螺杆菌生物膜的主要组成部分，而是参与了基因重组的过程，从而造成种群基因的多样性。eDNA在生物膜形成初期被OMV保护，有利于细菌之间活跃动态的信息交换，是基因水平转移主要的信号分子。

(二)幽门螺杆菌生物膜形成的影响因素

对细菌生物膜形成动力学研究的大量实验表明，细菌的自动聚集、运动性和疏水性是生物膜形成的重要因素[13-14]。然而，Yonezawa 等[15]的研究发现，这些因素对生物膜形成能力很强的幽门螺杆菌TK1402菌株并没有显著的影响。而TK1402菌株在细胞过度生长时出现了生物膜合成的减少，但转入含有7%胎牛血清的布氏肉汤中则恢复了很强的生物膜合成能力。因此可认为细菌生长是幽门螺杆菌生物膜合成的重要影响因素。

(三)幽门螺杆菌生物膜形成相关的密度感应系统

细菌生物膜的形成是一个动态演化过程。生物膜中的细菌在生长过程中会分泌一种或多种诱导分子到外环境中。随着细菌数量的增加，其分泌信号分子的浓度也随之增加。当浓度达到一定的阈值时可激发一系列特定的基因表达，以调节细菌的群体行为，这种现象称为密度感应(quorum sensing，QS)[16]。QS 系统是细菌之间信号传递的一种重要机制，细菌通过感应这些诱导分子来判断菌群密度和周围环境变化，避免细菌因过度生长而造成空间和营养物质缺乏;更重要的是通过QS系统共同对周围环境刺激做出反应，极大提高了整个细菌群体的生存能力[17]。

1.幽门螺杆菌中的QS系统 幽门螺杆菌中存在革兰阳性和阴性细菌共同的LuxS/自身诱导素2(autoinducer-2，AI-2)QS系统。AI-2作为其信号分子具有高度保守性，能被不同种属细菌识别，其合成主要依赖于在许多菌属中序列保守的luxS基因编码的LuxS蛋白酶[18]。AI-2以密度依赖性方式在菌体环境中积累存在。当AI-2增加到一定浓度时便可与luxS蛋白特异性结合并激活转录，从而调节一系列下游基因如化学感受体基因tlpB、化学转换基因cheA和cagE IV型分泌基因的表达，从而促使一系列效应产物的生成。目前的研究已发现受体LuxQP途经、ABC转运子LsrB途经和RbsB蛋白途经3种AI-2的感应调控机制。但这些途经的通路在幽门螺杆菌中的作用仍需更深入的实验证实。关于AI-2在幽门螺杆菌中调节作用的最新报道来自Rader等[19]的研究，细菌通过化学感应受体tlpB将AI-2作为化学排斥剂来感应，这一作用与细菌的泳动功能相关。

2.QS系统在幽门螺杆菌生物膜形成中的作用 有研究显示，当检测一种多个基因发生特定突变的幽门螺杆菌菌株产生的生物膜效应时，luxS和cagE IV型分泌基因突变体形成的生物膜作用效率是野生型菌株的2倍[20]。分析其原因认为，luxS基因的突变增加了幽门螺杆菌特异性生物膜的形成;另一方面，cagE IV型分泌系统形成巨大的膜孔使得部分蛋白通过该系统分泌。但对于幽门螺杆菌的生存，cag毒力岛并非必需，转录该操纵子所需的额外能量消耗阻碍了生物膜的有效形成，而对cag基因的破坏则可能造成膜表面pH值和疏水性的改变，使得突变体具有更强的黏附能力。由此可推断luxS和cagE基因之间存在着相互作用，表明一定数量的基因对于幽门螺杆菌形成的生物膜的重要性。

另外，为了验证幽门螺杆菌感染导致的胃部疾病可能是生物膜顽固性的一种表现形式，Celini等[21]对幽门螺杆菌感染患者的胃组织进行了活检。他们发现，在幽门螺杆菌大量 S形形态之中，也存在球形形态菌嵌入基质中。球形形态菌含有glmM组成型基因。在对幽门螺杆菌阳性患者样本的逆转录PCR检测显示，所有glmM阳性的样本LuxS群体效应相关基因同样也是阳性。这也表明LuxS群体效应是幽门螺杆菌生物膜形成的可靠指标。

三、幽门螺杆菌生物膜的耐药机制

根据目前的治疗指南，幽门螺杆菌感染的根除治疗主要有2种:含质子泵抑制剂(protonpumpinhibitor，PPI)和2种抗菌药物(克拉霉素和阿莫西林)的三联疗法[22]或含PPI、铋剂、四环素、甲硝唑的四联疗法[23]。然而，随着幽门螺杆菌对甲硝唑和克拉霉素耐药的增加，这一传统三联疗法对幽门螺杆菌的根除率在全世界范围内不断下降。美国、南欧和部分亚洲国家对受试者意向治疗(intention-to-treat，ITT)分析的大样本临床研究结果[24]显示，该方案幽门螺杆菌根除率已下降至80%以下。大量研究表明，幽门螺杆菌生物膜的形成在很大程度上导致了耐药菌株的增加，其耐药机制主要有渗透与营养限制、对抗免疫防御系统、基因水平转移和外排泵基因异常表达四种学说。

(一)渗透与营养限制

幽门螺杆菌生物膜基质的屏障作用是这一机制的关键。作为一种蛋白质和碳水化合物相互依赖的复合基质，幽门螺杆菌生物膜EPS带有的大量阴离子能通过氢键、共价键、范德华力吸附部分带有阳离子的抗菌药物;另外，EPS含有多种抗菌药物降解酶，导致抗菌药物的水解和钝化灭活[5]。

另一方面，生物膜结构的复杂性和其代谢活动造成深层菌不易获得足够的营养和氧气，从而生长缓慢或处于休眠状态。而大部分的抗生素主要针对代谢活跃的细菌，因此深层菌在很大程度上增强了幽门螺杆菌生物膜的耐药性[25]。由于局部代谢产物的堆积使得深层菌处于偏酸的微环境中，需要中性理化环境的克拉霉素的抗菌活性在偏酸性的生物膜深层大大降低。抗菌药物能够很快地根除表层菌。但当停药后，残存在深层的细菌可迅速繁殖形成新的生物膜，造成了临床上感染的反复发作，难以治愈，也可能导致了生物膜对抗菌药物耐受的遗传性。

(二)对抗机体免疫防御系统

幽门螺杆菌生物膜的大量黏性基质形成物理屏障，限制了吞噬细胞呼吸爆发产生的活性氧产物渗透进入生物膜，导致吞噬细胞无法破坏生物膜内细菌[26]。另外，包裹细菌的黏性基质以及细菌释放出的抗原性物质刺激机体产生大量的特异性抗体。这些抗体与可溶性抗原结合形成免疫复合物，沉积在感染病灶周围，与黏附菌体诱导胃上皮细胞产生的白细胞介素8(interleukin 8，IL-8)[27]共同趋化大量中性粒细胞浸润并释放蛋白水解酶。这种免疫复合物效应能引起宿主严重的免疫损害[26]，但却无法对生物膜中的细菌起作用。

(三)基因水平转移(horizontal gene transfer，HGT)

HGT是指在细菌生物膜中两个不同菌株之间的基因传递。细菌生物膜的环境决定了其中常包含一种或多种共生的物种，而这成为了连接QS系统和生物膜的纽带。有研究表明，2个不同的幽门螺杆菌菌株共培养时会表现出更高的黏附能力，存在更高的遗传异质性[28];另外，幽门螺杆菌也可能获得其他物种诱导的防御机制，产生提高对宿主自然免疫杀伤耐受的外膜蛋白的能力，使得菌体下一代具有更好的适应性和更强的毒力[29]。

(四)外排泵基因异常表达

细菌通过外排泵将抗菌药物排出是产生多重耐药性的重要机制。大量对幽门螺杆菌耐药菌株外排泵系统的研究显示，外排泵基因 hp605、hp971、hp1327和hp1489及其相应mRNA的表达在生物膜中显著上升[30]。这一发现表明幽门螺杆菌生物膜环境可能诱导了部分基因的异常表达，但机制尚未清楚。

四、针对幽门螺杆菌生物膜的防治策略进展

(一)N-乙酰半胱氨酸 (N-acetylcysteine，NAC)治疗

NAC作为一种粘蛋白溶解剂和含硫醇的抗氧化剂，在对抗以铜绿假单胞菌为代表的生物膜细菌造成的慢性上呼吸道感染中已得到广泛应用[31]。Cammarota等[32]开展了一项观察 NAC 在耐药幽门螺杆菌感染患者中疗效的非盲随机试验。结果显示，NAC处理组的幽门螺杆菌根除率高于对照组，且这一效应不受幽门螺杆菌基因型的影响。NAC虽没有直接针对幽门螺杆菌的活性，但其能够通过降低感染部位黏液的厚度使得其他抗菌药物(兰索拉唑+克拉霉素)更好地被递送;另外，NAC可能干扰了细菌的抗原决定簇，使细菌暴露在酸性环境中，导致了抗原的退化;同时其也降低了黏膜上的氧化剂含量，使得幽门螺杆菌感染期间炎症反应正常进行[33]。

(二)中药制剂治疗

有研究显示了一些中药制剂如大黄素、黄连素、苦参碱、黄芩苷等对耐药幽门螺杆菌存在抑制作用，在低于50%最小抑菌浓度 (minimal inhibitory concentration，MIC)时，这些药物能明显抑制耐药幽门螺杆菌生物膜形成[34-35]。其原因可能是中药提取物含有的有机硫化合物能够穿过细菌细胞壁磷脂双份子层，更容易破坏生物膜结构的EPS，从而更好地渗入深层，起到杀菌作用。

(三)其他

Campli等[36]研究认为，低频电场在幽门螺杆菌生物膜中能够诱导黏附细菌表型的改变，降低细菌的黏附，使细菌种群失去平衡，从而降低幽门螺杆菌自身保护的能力。另外，由于QS信号系统在幽门螺杆菌生物膜中起中心调节作用，国内外学者设想它可能是一个控制感染性疾病的新靶点，希望通过它来对抗生物膜相关耐药机制以达到治疗目的，但其临床意义有待进一步研究。

五、问题与展望

对于幽门螺杆菌生物膜的研究目前仅处在初始阶段，有很多基础问题有待解决，包括生物膜的形成机制、形成过程中所需的条件和信号、细菌胞外基质与宿主胞外基质直接的相互作用、QS系统的起始和靶基因表达调节与交叉交流、细菌群体的功能性分工等，特别是在耐药机制和遗传性状方面更需要深入研究。目前，幽门螺杆菌生物膜形成的相关基因是这一领域的研究热点。另一方面，用于预防幽门螺杆菌感染的高效无毒疫苗已通过了动物试验[37]。这些都将为治疗耐药性幽门螺杆菌造成的临床感染带来希望。

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