甘肃省紫花苜蓿种带促生多粘类芽孢杆菌的分离与鉴定

张振粉，南志标

（草地农业生态系统国家重点实验室 兰州大学草地农业科技学院，甘肃 兰州730020）

多粘类芽孢杆菌（Paenibacilluspolymyxa）原属于多粘芽孢杆菌（Bacilluspolymyxa），Ash等［1］于1993年将其新归于类芽孢杆菌属。多粘类芽孢杆菌是一种植物非致病性产椭圆形芽孢的革兰氏阳性细菌，可以从土壤、小麦（Triticumaestivum）和牧草根际中分离得到［1］。多粘类芽孢杆菌是一种功能性极强的微生物，具有分泌植物激素（如细胞分裂素、吲哚乙酸等）和提供氮素等特性，促进植物生长［2－5］；Zhao等［6］从黄瓜（Cucumissativus）根际土壤中分离的多粘类芽孢杆菌BMP－11菌株提取了可以抗真菌，抗虫和除草活性的挥发性化学物质；Lai等［7］研究发现，从越南槐（Sophoratonkinensis）分离得到的多粘类芽孢杆菌SG－6菌株同样具有防止柑橘（Citrusreticulata）采后发霉的作用；同时它还能产生肽类［8－9］、蛋白质类［10］、核苷类［11］、吡嗪类［12］和酚类［2，13］等多种抗菌物质，防治多种植物病害［14－19］。童蕴慧等［20］将多粘类芽孢杆菌 W3、Y2菌株和地衣芽胞杆菌（Bacillus licheniformis）W10菌株接种致病番茄（Lycopersiconesculentum）后，诱导其植株对灰霉病菌（Botrytiscinerea）产生系统抗性。此外，由于出色的固氮能力，多粘类芽孢杆菌还可被应用于消除油菜（Brassicacampestris）体内的有害硝酸盐，从而提高油菜品质［21］。多粘类芽孢杆菌是被美国环境保护署（EPA）列为可商业应用的微生物种类之一，我国农业部也将其列为免做安全鉴定的一级菌种，目前报道该菌可用于农业、工业和水处理等方面［22］。

紫花苜蓿（Medicagosativa）在我国已有2000多年的栽培历史，是重要的多年生豆科牧草，以其产量高，具有保持水土和改善土壤结构的功能，是北半球温带地区最主要的牧草、草田轮作的首选豆科牧草，在农牧业生产中有着不可替代的作用［23－24］。李春杰和南志标［25］系统研究了苜蓿种带真菌的区系及其致病性。郭玉霞等［26］对黄土高原区苜蓿与小麦轮作系统根部入侵真菌进行了详细研究。有关紫花苜蓿种带细菌区系的研究在国内尚属空白，本研究以甘肃省不同紫花苜蓿产地的种子为材料，分离其细菌区系，经发芽试验筛选了一种促进苜蓿生长的细菌。Biolog及生理生化分析确定该菌株属于多粘类芽孢杆菌，紫花苜蓿种子发芽试验测定结果显示该菌株具有促进苜蓿苗生长的作用。该菌株的分离与鉴定对于探讨甘肃省不同紫花苜蓿种植区有益菌多粘类芽孢杆菌的生态分布提供了理论基础，并为紫花苜蓿在草地早期建植的应用提供了新的菌种资源。

1 材料与方法

1．1 材料

1）种样

供试种样源自农业部牧草与草坪草种子质量监督检验测试中心（兰州）低温种质资源库的13种不同产地和不同收获年限的紫花苜蓿种子，每种各3份，共计39份（表1）。

表1 紫花苜蓿种子收获年份和地点及其地理气候信息Table 1 Harvest time and harvest location of M． sativa seed samples and their geographical and climatic information

2）培养基

分离、纯化及活化分离物的培养基为肉汁胨培养基（NA）（蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂18g，蒸馏水1L，121℃下灭菌30min）和固氮能力测试所用培养基为阿须贝培养基（Ashby medium）（葡萄糖：10g，KH2PO40．2g，MgSO4·7H2O 0．2g，NaCl 0．2g，CaSO4·2H2O 0．2g，CaCO35．0g，蒸馏水1L，113℃下灭菌30min）［27］。

1．2 方法

1）细菌的分离

种子表面消毒分离：各产地紫花苜蓿种子称取1g为样品，经75%乙醇2min和1%次氯酸钠5min进行表面消毒，继之以无菌水冲洗4～5次［28］。将表面消毒后的苜蓿种子置于灭菌的研钵中研碎，转移种子粉末至装有100mL无菌蒸馏水的250mL的三角瓶中于恒温摇床25℃、100r／min震荡5min，随后取1mL悬浮液制成不同浓度梯度（10－1，10－2和10－3），每个梯度取200μL，转置NA培养基中央涂抹，使之均匀地布满整个培养基，重复3～4皿，（28±1）℃下培养3d。

种子发芽分离及冲洗分离：将紫花苜蓿种子样品浸泡于100mL无菌蒸馏水的三角瓶（250mL）中，于恒温摇床25℃、150r／min震荡10min，取1mL悬浮液制成不同浓度梯度（10－1，10－2和10－3），每梯度取200μL涂板，重复3～4皿，（28±1）℃下培养3d。

在上述培养平板上挑取相似细菌分离物单菌落，对其进行编号，纯化后在－80℃添加甘油的NA培养基中长期保存和4℃下NA培养基中短期保存。

2）Biolog鉴定

纯化得到的8株细菌分离物HTBRC 1～8和购于中国农业微生物菌种保藏管理中心的多粘类芽孢杆菌模式菌株ACCC 10252于NA平板28℃活化培养24h后备用，按照Biolog自动快速微生物鉴定系统（Biolog Inc．，Hayward，CA）说明书操作。根据2006年的数据库显示，Biolog能鉴定革兰氏阴性菌524种（106个属）和革兰氏阳性菌351种（55个属）。此实验于2011年12月，在草地农业生态系统国家重点实验室草类病理实验室进行。

3）表型鉴定

纯化得到的8株细菌分离物 HTBRC 1～8和ACCC 10252菌株，参照《常见细菌系统鉴定手册》［29］和《Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology》［30］对其进行菌体形态观察并照相 （Biomicroscope Olympus BX51），革兰氏染色反应，鞭毛染色反应以及厌氧生长试验、接触酶试验、氧化酶试验、硝酸还原试验、淀粉水解试验、明胶液化试验、硝酸盐还原试验、V－P试验、吲哚试验和糖醇类发酵等生理生化指标测定。

4）发芽试验

将NA平板28℃培养24h后的代表细菌分离物HTBRC1制成108cfu／mL菌悬液。取1g紫花苜蓿种子（阿尔冈金品种）浸泡于HTBRC1的悬浮液中5min后，设种子浸泡于无菌水为对照，取出后于无菌滤纸上自然晾干。将晾干的种子参照GB／T 2930．4－2001进行发芽，4d后开始统计发芽率，测量根长和苗长，并观察真菌侵染种子发芽现象。整个试验重复2次。

1．3 统计分析

采用SPSS 13．0软件进行方差分析和显著性测定，试验中的发芽率数据是经反正弦转换所得，方差分析采用独立样本T检验。

2 结果与分析

2．1 细菌的分离

试验从13个不同苜蓿种子产地的8个中，分离得到在NA培养基上形成粉红色，隆起，粘稠状，具有很强的粘性，表面湿润光滑边缘整齐的细菌分离物（图1A）；革兰氏染色阳性，菌体杆状，大小为0．5～2．5μm×1．2～10 μm（图1B）。我们将这8个产地分离得到的代表性分离物进行编号后备用，它们分别为HTBRC1、HTBRC2、HTBRC3、HTBRC4、HTBRC5、HTBRC6、HTBRC7和 HTBRC8（表2）。

图1 细菌分离物HTBRC 1～8的形态特征Fig．1 The morphology characteristic of bacterial isolates HTBRC 1－8

2．2 Biolog鉴定

8株分离自苜蓿的细菌分离物HTBRC 1～8和在Biolog GP2鉴定板上培养4～6h时与Biolog数据库比对结果显示为“NO ID”，培养20h时它们与Biolog数据库中的多粘类芽孢杆菌相似度为0．533～0．880。根据Biolog自动快速微生物鉴定系统（Biolog Inc．，Hayward，CA）说明，相似度于菌株培养4～6h时≥0．75，鉴定结果可靠；相似度于菌株培养16～24h时≥0．5，鉴定结果可靠。表2结果显示与培养20h时它们在Biolog数据库中的多粘类芽孢杆菌相似度均大于0．5，说明结果可靠。因此，根据Biolog鉴定结果，HTBRC 1～8均初步鉴定为多粘类芽孢杆菌。

表2 紫花苜蓿种带细菌分离物和ACCC 10252菌株来源及其Biolog鉴定结果Table 2 Source of M ． sativa seed－borne bacterial isolates and ACCC 10252strain and their results of Biolog identification

2．3 生理生化鉴定

8株分离自苜蓿的细菌分离物HTBRC 1～8和ACCC 10252菌株的生理生化指标详见表3。这8个细菌分离物与ACCC 10252菌株生理生化指标基本相似，其最大的特点是较模式菌株具有更高的盐耐受性和固氮能力，它们可在添加5%NaCl的NA平板上生长并在阿须贝无氮培养基连续生长3代以上。根据《常见细菌系统鉴定手册》［29］和《Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology》［30］初步鉴定 HTBRC 1～8为多粘类芽孢杆菌。

2．4 发芽试验

用代表菌株HTBRC1菌悬液浸种后，苜蓿种子的发芽率和发芽势较未浸泡过的显著增加，根长均具有显著提高（P＜0．05），苗长有小幅增长，但差异不显著（P＞0．05）（图2）。此外，经菌悬液浸泡过的种子在发芽过程中肉眼未见种带致病真菌危害苜蓿芽的生长，相反未经菌悬液浸泡过的种子在发芽过程中有真菌侵染现象。

3 讨论

本研究首次于紫花苜蓿种子上分离得到多粘类芽孢杆菌，发现了该菌可于种子表面及内部存活，新记录了该菌的生境。这些紫花苜蓿种子分别是2002，2004，2006和2009年入库的，来自位处河西走廊的临泽，黄土高原的环县和西峰等，以及青藏高原的玛曲。由此可知，该菌可在紫花苜蓿种子上存活达10年之久，它在甘肃省不同紫花苜蓿种植区的分布与年降水量和年均温没有明显的关系。该菌可以从土壤、小麦和牧草根际中分离得到［1］，因此它的分布可能与当地土壤类型或牧草与小麦等农作物轮作，套作等方式相关。

图2 多粘类芽孢杆菌浸种14d后的紫花苜蓿种子发芽势和发芽率（A）以及根长和苗长（B）Fig．2 Germination index and percent of seed germination（A）and shoot and root length（B）of lucerne seeds after soaked with P． polymyxa after 14d

本试验8个细菌分离物的生理生化鉴定与Biolog鉴定结果一致，初步鉴定HTBRC 1～8菌株均为多粘类芽孢杆菌。该试验结果验证了Biolog自动快速微生物鉴定系统相似度于菌株培养4～6h时≥0．75时或菌株培养16～24h时≥0．5时，鉴定结果可靠。表型鉴定进一步验证了Biology鉴定的可靠性。Biolog技术因其数据库容量大，种类齐全；鉴定结果准确率高；鉴定周期短，最快4个小时出结果；操作简单，对操作者技术要求不高等特点。已在临床、食品、植物病理、微生物生态、兽医等领域得到广泛应用［31－32］。

分离于紫花苜蓿种子的多粘类芽孢杆菌HTBRC 1～8具有比多粘类芽孢杆菌ACCC 10252更强的耐盐性。但使用多粘类芽孢杆菌HTBRC1等浸泡的紫花苜蓿种子，是否将更能适应盐渍地帮助紫花苜蓿度过较高盐浓度的胁迫，有待进一步的研究。在试验过程中用代表菌株多粘类芽孢杆菌HTBRC1浸泡过的种子比未浸泡的种子具有更好的发芽率，发芽势，根长和苗长，这将有助于紫花苜蓿在自然生态环境下形成建植优势。本试验证明了多粘类芽孢杆菌可以促进紫花苜蓿生长，该实验结果与国内外报道的多粘类芽孢杆菌具有促进植物生长的结果一致［4，13，17，33］；并在试验过程发现未经多粘类芽孢杆菌菌悬液浸泡过的苜蓿种子在发芽试验中有真菌侵染苜蓿芽，影响其发芽的现象，但未鉴定其苜蓿芽侵染真菌的种类，有待后续研究多粘类芽孢杆菌对病原真菌的拮抗作用及其机制。

表3 紫花苜蓿种带菌株HTBRC 1～8和多粘类芽孢杆菌ACCC 10252的表型特征Table 3 Phenotypic characteristics of HTBRC 1－8from M． sativa seeds and P． polymyxa ACCC 10252

本研究首次明确了多粘类芽孢杆菌在甘肃省不同紫花苜蓿种植区所收获种子上的分布。分离自紫花苜蓿种子表皮及内部的多粘类芽孢杆菌具有较高耐盐性和促进紫花苜蓿生长的新特性。本研究为苜蓿生产提供了菌种资源及其理论基础。

致谢：承蒙兰州大学草地农业科技学院王彦荣教授惠赠紫花苜蓿种子资源和曾彦军副教授在种子选择时给予的有益建议，甘肃农业大学陈秀蓉教授和杨成德及兰州大学草地农业科技学院段廷玉副教授在技术方面，兰州大学草地农业科技学院王玮和邹德福在气象数据方面提供的帮助，谨此一并致谢。

［1］Ash C，Priest F G，Collins M D．Molecular identification of rRNA group 3bacilli（Ash，Farrow，Wallbanks and Collin）using a PCR probe test proposal for the creation of a new genusPaenibacillus［J］．Antonie Leeuwenhoek，1993，64：253－260．

［2］Lebuhn M，Heulin T，Hartmann A．Production of auxin and other indolic and phenolic compounds byPaenibacilluspolymyxastrains isolated from different proximity to plant roots［J］．FEMS Microbiology Ecology，1997，22：325－334．

［3］Timmusk S，Nicander B，Granhall U，etal．Cytokinin production byPaenibacilluspolymyxa［J］．Soil Biology and Biochemistry，1999，31：1847－1852．

［4］Holl F B，Chanway C P，Turkington R，etal．Response of crested wheatgrass（AgropyroncristatumL．），perennial ryegrass（Loliumperenne）and white clover（TrifoliumrepensL．）to inoculation withBacilluspolymyxa［J］．Soil Biology and Biochemistry，1988，20：19－24．

［5］Larsen J，Cornejo P，Barea J M．Interactions between the arbuscular mycorrhizal fungusGlomusintraradicesand the plant growth promoting rhizobacteriaPaenibacilluspolymyxaandP．maceransin the mycorrhizosphere ofCucumissativus［J］．Soil Biology and Biochemistry，2009，41：286－292．

［6］Zhao L J，Yang X N，Li X Y，etal．Antifungal，insecticidal and herbicidal properties of volatile components fromPaenibacilluspolymyxastrain BMP－11［J］．Agricultural Sciences in China，2011，10：728－736．

［7］Lai K P，Chen S H，Hu M Y，etal．Control of postharvest green mold of citrus fruit by application of endophyticPaenibacilluspolymyxastrain SG－6［J］．Postharvest Biology and Technology，2012，69：40－48．

［8］O’Dowd H，Kim B，Margolis P，etal．Preparation of tetra－Boc－protected polymyxin B nonapeptide［J］．Tetrahedron Letters，2007，48：2003－2005．

［9］Kajimura Y，Kaneda M．Fusaricidins B，C，and D，new depsipeptide antibiotics produced byBacilluspolymyxaKT－8：isolation，structure elucidation and biological ac－tivity［J］．Journal of Antibiotics，1997，50：220－228．

［10］Saravanakumar K，Sivanesan S，Samuel G，etal．Isolation and partial characteriza－tion of antifungal protein fromBacillus polymyxastrain VLB16［J］．Process Biochemistry，2005，40：3236－3243．

［11］Piuri M，Sanchez－Rivas C，Ruzal S M．A novel antimicrobial activity of aPaenibacilluspolymyxastrain isolated from regional fermented sausages［J］．Letters in Applied Microbiology，1998，27：9－13．

［12］Beck H C，Hansen A M，Lauritsen F R．Novel pyrazine metabolites found in polymyxin biosynthesis byPaenibacilluspolymyxa［J］．FEMS Microbiology Letters，2003，220：67－73．

［13］Egamberdiyeva D．The effect of plant growth promoting bacteria on growth and nutrient uptake of maize in two different soils［J］．Applied Soil Ecology，2007，36：184－189．

［14］Gu L K，Bai Z H，Jin B，etal．Production of a newly isolatedPaenibacilluspolymyxabiocontrol agent using monosodium glutamate wastewater and potato wastewater［J］．Journal of Environmental Sciences，2010，22：1407－1412．

［15］马桂珍，王淑芳，暴增海，等．多粘类芽孢杆菌L1－9菌株对番茄早疫病的抑菌防病作用［J］．中国蔬菜，2010，（12）：55－59．

［16］徐玲，王伟，魏鸿刚，等．多粘类芽孢杆菌HY96－2对番茄青枯病的防治作用［J］．中国生物防治，2006，22（3）：216－220．

［17］曹明慧．防治土传烟草黑胫病微生物有机肥的研制与生物效应研究［D］．南京：南京农业大学，2010．

［18］陈海英，林健荣，廖富蘋，等．多粘类芽孢杆菌CP7对荔枝霜疫霉菌的抗菌活性及其作用机制［J］．园艺学报，2010，37（7）：1047－1056．

［19］陈雪丽，王光华，金剑，等．多粘类芽孢杆菌BRF－1和枯草芽孢杆菌BRF－2对黄瓜和番茄枯萎病的防治效果［J］．中国生态农业学报，2008，16（2）：446－450．

［20］童蕴慧，郭桂萍，徐敬友，等．拮抗细菌对番茄植株抗灰霉病的诱导［J］．中国生物防治，2004，20（3）：187－189．

［21］宿燕明，彭霞薇，吕欣，等．多粘类芽孢杆菌对油菜中硝酸盐含量的影响［J］．中国农学通报，2011，27（12）：144－148．

［22］杨少波，刘训理．多粘类芽孢杆菌农用活性研究进展［J］．微生物学通报，2008，35（10）：1621－1625．

［23］郭玉霞，南志标，王成章，等．苜蓿根部入侵真菌研究进展［J］．草业学报，2009，18（5）：243－249．

［24］Zhang Z F，Nan Z B．First report ofErwiniapersicinuscausing wilting ofMedicagosativasprouts in China［J］．Plant Disease，2012，96：454．

［25］李春杰，南志标．苜蓿种带真菌及其致病性测定［J］．草业学报，2000，9（1）：27－36．

［26］郭玉霞，南志标，李春杰，等．黄土高原苜蓿与小麦轮作系统根部入侵真菌研究［J］．生态学报，2004，24（3）：486－494．

［27］张振粉．牧草内生枯草芽孢杆菌的功能多样性及其16SrDNA鉴定［D］．兰州：甘肃农业大学，2010．

［28］Nan Z B．Fungicide seed treatments of sainfoin control seed－borne and root－invading fungi［J］．New Zealand Journal of Agricultural Research，1995，38：413－420．

［29］东秀珠，蔡妙英．常见细菌系统鉴定手册［M］．北京：科学出版社，2001．

［30］Vos P D，Garrity G M，Jones D，etal．Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology（Second Edition，Volume Three）［M］．New York：Springer Print，2009．

［31］谢关林，朱国念，任小平．浙江水稻稻种病原细菌多样性研究［J］．植物病理学报，2002，32（2）：114－121．

［32］Kaneshiro W S，Burger M，Vine B G，etal．Characterization ofErwiniachrysanthemifrom a bacterial heart rot of pineapple outbreak in Hawaii［J］．Plant Disease（e－Xtra），2008，92：1444－1450．

［33］Khan Z，Kim S G，Jeon Y H，etal．A plant growth promoting rhizobacterium，Paenibacilluspolymyxastrain GBR－1，suppresses root－knot nematode［J］．BioResource Technology，2008，99：3016－3023．