根际促生菌筛选及其接种剂对箭筈豌豆生长影响的研究

马文彬，姚拓，王国基，张玉霞，荣良燕

（甘肃农业大学草业学院 草业生态系统教育部重点实验室，甘肃 兰州730070）

土壤微生物是土壤有机复合体的重要生物组成部分，在有机物质分解、物质循环和生态安全调控等方面发挥着重要作用，适宜群居在具有一定界限的微域环境里，如根际微域。植物根际的微生物多而活跃，由于受根系生长及其分泌物的影响，根际微生态区域土壤微生物的数量和种群结构显著不同于非根际土壤，构成了根际特有的微生物区系。植物根际促生菌（PGPR）是一类定殖于植物根际，可通过固定空气中的氮气（即生物固氮）或溶解土壤中不能被植物直接吸收利用的磷素（即生物溶磷）或产生植物生长激素刺激植物生长以增强其吸收矿物营养和水分的能力，从而促进植物生长［1－3］的有益菌。自1978年Burr和Schroth在马铃薯（Solanumtuberosum）上率先报道PGPR以来，大量的研究事实证实PGPR广泛存在于多种植物，近年来，国内外学者已从一些植物根际分离筛选出大量高效优良的根际促生菌株［4－5］，利用优良促生菌株研制的“环境友好型”接种剂还可改良土质，增进土壤肥力，维持土壤健康，是发展生态农业的理想肥料。

箭筈豌豆（Viciasativa）是粮、草、饲、肥兼用作物之一，在我国草地农业系统中起着举足轻重的作用，与燕麦（Avenasativa）混播，调制青干草，用于冬春补饲，是解决牧区家畜营养不足的有效措施［6－8］；其根茬还田可培肥地力、增加后作产量，还能改善土壤理化性状、提高土壤有机质含量及促进农田养分循环［9］，同时是优良的水土保持和固沙植物，具有饲用和生态双重价值。

根系是植物吸收水分和养分的重要组织器官，其形态发育影响作物的生长及对营养的吸收，其中根系长度和根表面积对主要借扩散抵达根表面的那些养分有效性具有决定性作用，因此研究根的形态学特征（总根长、根系表面积、根系平均直径及根系体积等）有着重要意义。近年来，关于氮、磷等植物必需营养元素及干旱胁迫对根系形态影响的研究越来越多［10－13］，而生物因素尤其是微生物对根系形态的影响鲜有报道。为此，本研究以箭筈豌豆为研究对象，从箭筈豌豆及玉米（Zeamays）根际分离筛选优良促生菌，并研制微生物接种剂，结合半固体培养液试验研究接种剂对箭筈豌豆生长及根系形态的影响，为箭筈豌豆的优质、高产生产及推广提供理论依据和技术支撑。

1 材料与方法

1．1 供试材料

箭筈豌豆根系及根际土壤，2013年9月采自甘肃农业大学牧草试验站；玉米根系及根际土壤，2013年8月采自甘肃省武威黄羊镇牧草试验站。箭筈豌豆种子，品种为春箭筈豌豆，由甘肃农业大学草业学院种子室提供。接种剂对箭筈豌豆生长影响测定于2014年1月下旬至3月上旬进行。

1．2 培养基

LB（溶菌肉汤培养基）［14］：用于活化及保存菌种；NFM（无氮培养基）［14］：用于联合固氮菌分离及固氮酶活性测定；PKO（Pikovaskaia’s）［14］：用于溶磷菌分离及溶磷量测定；YMA（甘露醇硝酸盐琼脂培养基）［14］：用于根瘤菌分离及培养；CCM（联合碳源培养基）［14］：用于分泌生长素测定；Hoagland（霍格兰）半固体培养基［15］：提供箭筈豌豆幼苗营养。

1．3 优良促生菌株分离筛选

1．3．1 菌株分离 按常规分离细菌法分别涂布样品悬液于PKO及NFM固体培养基平板上，28℃倒置于恒温培养箱中培养，挑取在PKO平板上出现透明圈的分离物进行纯化并保存；在NFM平板上挑取长势较好的分离物进行纯化保存。

将所采集新鲜的箭筈豌豆根瘤用无菌水洗净，0．1%升汞消毒3min，挑取中间部位，在YMA培养基平板上点接或划线，分离得到的菌株进一步纯化保存于冰箱中备用。

1．3．2 菌株溶磷性能测试 将菌株点接种至PKO固体培养基上，28℃条件下培养7d，观察菌落周围有无溶磷圈出现，并测定菌落直径与溶磷圈直径，定性判断菌株溶磷能力；制备上述菌株悬浮液（浓度约108cfu／mL），接种0．5mL菌悬液于盛有经灭菌的50mL PKO液体培养基的三角瓶中，每菌株3次重复，置于轨道摇床上（28℃，160r／min）培养10d，在4℃下离心（10000r／min）15min，取上清液用钼蓝比色法测定有效磷（P）的含量。

1．3．3 菌株固氮酶活性测定 利用NFM培养基，将供试菌株分别接种于盛有5mL半固体NFM培养基的血清瓶中（每菌株5次重复），结合气相色谱仪（Trace GC2000，Italy），利用乙炔还原法（acetylene reduction assay，ARA）测定菌株固氮酶活性［16］，按下式计算固氮酶活性。

式中，hx：样品峰值；hs：标准C2H4峰值；C：标准C2H4浓度（nmol／mL）；V：培养容器体积（mL）；t：样品培养时间（h）；N：产生的C2H4浓度（nmol／mL·h）。

1．3．4 菌株分泌IAA能力研究 取上述在CCM液体培养基上生长12d的菌株悬浮液40mL，盛于50mL离心管中（每菌株3次重复），在4℃，10000r／min下离心10min，弃去沉淀物，将上清液在冷冻干燥仪中干燥至10～15mL，并用HCl将PH值调至2．8。用乙酸乙酯提取生长素（IAA）（菌株悬浮液∶乙酸乙酯＝1∶3）。将提取液盛在烧杯中，置于通风橱中低温蒸发至干燥，再用2mL 100%乙醇溶解后盛在离心管中。同时配置50 μg／mL的IAA标准液。利用液相色谱法（HPLC）测定菌株IAA含量［17］。

色谱条件，色谱柱：ZORBAX SB－C18柱（4．6mm×150mm，5μm）；流动相：甲醇∶0．6%冰乙酸（45∶55）；柱温：25℃；流速1mL／min；检测波长：254nm；进样量：20μL。

1．3．5 菌株拮抗测定 菌株间的拮抗反应测试采用牛津杯法［18］，将一种菌在液体培养基中培养24h的菌悬液，以2%（V／V）的量接种到发酵培养基中，28℃、180r／min振荡培养48h；发酵液8000r／min离心10min，上清过0．22μm滤膜，取滤液100μL滴加在含有2%另一种细菌的LB平板中央的牛津杯中（直径7mm），待发酵滤液扩散后置28℃条件下恒温培养。以无菌水作阴性对照。将供试4株细菌两两进行抑菌实验，每个处理3次重复，1d后观察抑菌圈的有无，若有抑菌圈，说明两细菌间有拮抗作用，若无抑菌圈，且细菌生长良好，则说明这两个细菌可以共存，各菌株间没有拮抗作用，不发生拮抗反应的菌株可以混合培养，否则只能单独施用。

1．4 对箭筈豌豆生长影响测定

1．4．1 菌悬液制备 将LB斜面培养基上生长72h的上述菌分别接种于100mL LB液体培养基中，置于28℃，125r／min的摇床培养3～5d，测定A660值，使A660值均大于0．5，无菌水调节A660值一致（使菌数量处于同一水平），制成菌悬液，并按表1设置处理（注：菌株种类及其组合、体积比等正在申报专利）。

表1 试验处理Table 1 Design of experiment

1．4．2 种植 选取籽粒饱满、大小均一的春箭筈豌豆种子，将种子先用75%的酒精灭菌处理15s，然后用无菌水冲洗4～5次，再经0．1%HgCl2灭菌处理1min后，用无菌水冲洗干净，将种子置于灭菌后的水琼脂培养基平板中，置于培养箱（25℃，16h光照，20000lx；20℃，8h黑暗）中培养，待种子芽长1～2cm，将箭筈豌豆幼苗移至装有40mL无菌Hoagland水琼脂半固体培养基的长玻璃试管（4cm×45cm）中，每个试管1株幼苗，置于培养箱中培养，2d后观察，去除移栽后死亡的幼苗。

1．4．3 接种 将1．4．1中各菌悬液1mL在无菌条件下接入1．4．2所培养的幼苗根际，接种后将试管继续置于培养箱中培养。设1组对照，每个处理5次重复。

1．4．4 测定项目与方法 经处理的幼苗培养40d后收获，用无菌水洗净根表培养基，测量株高及根长；剪去地上部分，利用根系扫描仪（LA2400Scanner，Epson Expression 1000XL）测定根表面积、根体积及根平均直径；用滤纸吸干植株及根系表面水分，分别称量其地上部分和地下部分鲜重；根系活力的测定采用TTC（氯化三苯基四氮唑）法进行根系还原力的测定。

1．5 数据处理

利用Excel 2007整理数据，SPSS 17．0进行方差分析，采用Duncan法进行多重比较。

2 结果与分析

2．1 优良促生菌株促生特性

通过测定菌株的溶磷、固氮及分泌生长素能力，筛选出了4株优良菌株，包括2株溶磷菌，1株联合固氮菌，1株根瘤菌（表2）。其中，菌株J3－1和J1－15为溶磷菌，兼具分泌生长素特性，Y16为联合固氮菌，兼具溶磷及分泌生长素性能，J3为根瘤菌。4株菌株生长速度均较快，经测定均无拮抗作用。

2．2 接种剂对箭筈豌豆株高和生物量影响

2．2．1 接种剂对箭筈豌豆株高影响 通过测定接种剂对箭筈豌豆株高的影响，由表3得知，与G处理（CK，下同）相比，各接种剂对箭筈豌豆的株高影响各异。总体来说，复合接种剂的效果优于单一接种剂和CK，除处理C外，单一接种剂处理与CK差异不显著（P＞0．05），但处理B较CK增加4．5%。复合接种剂均较CK处理的株高增加22．9%～31．6%。单一接种剂中，C与A、B之间差异显著（P＜0．05），复合接种剂中，E、F与处理D差异显著（P＜0．05）。

表2 优良菌株促生特性Table 2 Characteristics of tested plant growth promoting rhizobacteria strains

表3 接种剂对箭筈豌豆株高和生物量影响Table 3 Effect of plant growth promoting rhizobacteria inoculum on height and biomass in vetch

2．2．2 接种剂对箭筈豌豆生物量影响 接种剂对箭筈豌豆地上生物量的影响与对株高的影响趋势基本一致，但C处理对地上生物量的影响优于复合接种剂，较CK增加了104．5%，且与复合接种剂差异显著（P＜0．05），A和B处理与CK相比，均有不同程度的下降，但与CK差异不显著；复合接种剂各处理较CK增加了42．6%～83．7%。各处理对地下生物量的影响比对株高和地上生物量的影响显著（P＜0．05），较CK增幅为51．5%～254．1%。综上所述，单一接种剂C及各复合接种剂处理对箭筈豌豆地上和地下部分均有良好的促进作用。

2．3 接种剂对箭筈豌豆根系形态影响

接种剂对箭筈豌豆根系形态的影响显著，观察根系外观形态（图1），接种促生菌剂后各处理均根系发达，侧根较多且细，主根较长；CK侧根短粗，数量较少，主根较短。接种剂对箭筈豌豆根系形态指标的影响表明（表4）：与CK相比，接种剂对根长、根表面积及根体积的影响均显著，各处理间差异也显著，且根表面积与根体积的变化趋势基本一致。其中，较CK相比，各处理对根长的增幅为30%～70%，处理F和C对根长的促进效果最为明显；各处理对根表面积影响的排序为：C＞F＞D＞E＞A＞B＞G，对根体积的影响为F＞C＞D＞E＞B＞A＞G，除处理C外，总体上表现出复合接种剂效果优于单一接种剂。接种剂处理对根平均直径的影响则相反，各处理较CK相比均有不同程度下降，且差异显著。

2．4 接种剂对不同根直径下箭筈豌豆根长和分布影响

由表5可见，接种剂处理对0～0．5mm内细根［19］根长影响显著。C处理0～1．0mm内的根长显著高于其他处理，而0．5～1．0mm级别下根长差异不大。分析根长在各级别的分布比例可知，接种剂各处理50%以上的根在0～0．5mm直径范围内，且接种植株该范围内根系长度所占比例明显高于未接种植株（图2），95%左右的箭筈豌豆根是在0～1．0mm的直径范围内，说明细根的多少决定根长的大小。

图1 接种剂对箭筈豌豆根系外观形态影响Fig．1 Effects of plant growth promoting rhizobacteria inoculum on root morphology in vetch

表4 接种剂对箭筈豌豆根系形态指标影响Table 4 Effect of plant growth promoting rhizobacteria inoculum on root traits of vetch

表5 接种剂处理对不同根直径下的总根长影响Table 5 Effect of inoculum on vetch in root length under different root diameter cm／株Plant

图2 接种剂对箭筈豌豆根系直径分级影响Fig．2 Effect of inoculum on vetch in different root diameter

2．5 接种剂对箭筈豌豆根系活力影响

如表6所示，不同接种剂处理下，箭筈豌豆根系活力变化明显。复合接种剂除E处理，其效果优于单一接种剂处理和CK，单一接种剂A处理与CK差异不显著。使用复合接种剂处理，箭筈豌豆根系活力较CK提高3．5%～38．3%，其中F处理效果最佳，与其他处理差异显著，D处理次之；单一接种剂C较CK增加8．0%，处理B虽与CK差异不显著，但与CK相比增加4．97%。这表明，复合接种剂处理提高根系活力效果明显，但因处理不同差异较大。

3 讨论

植物根际促生菌因具有多种有益生物学作用，成为国内外研究热点。Hamdali和Ouhdouch［20］从摩洛哥含无机磷酸盐土壤中分离出8株解磷放线菌，它们以植物根分泌物为营养，释放土壤中有机磷，可使该地区小麦（Triticumaestivum）地上部分增长70%，根增长30%。Mirz等［21］将分离自水稻（Oryzasativa）根际的固氮菌株AzospirillumN－4接种于水稻根际，测得水稻根系增重78．1%，茎秆增重59．0%。Oliveira等［22］通过温室试验证明，水稻接种联合固氮菌Herbaspirillum和Azospirillum后的固氮百分率分别为19%和47%。我国应用海洋细菌BAC－991的 PGPR对大豆（Glycinemax）、蔬菜等平均增产10．00%～18．19%，最高可达35%［23］。康贻军等［24］对豇豆（Vignasesquipedalis）的研究表明，接种两种促生菌后豇豆株高分别比对照提高14．39%和10．40%；茎叶干物重分别比对照增加19．69%和17．71%。刘佳莉等［25］利用从盐碱土壤中分离出的促生菌株A－2和A－4处理燕麦种子，可有效促进燕麦生长并提高燕麦的盐碱抗性。

表6 接种剂对箭筈豌豆根系活力影响Table 6 Effect of plant growth promoting rhizobacteria inoculum on root activity of vetch

本研究不同处理组合的接种剂对箭筈豌豆株高、生物量及部分根系形态等生长指标均有不同程度的促进作用，但处理之间差异较大。姚拓等［26］研究也证实，接种不同供试固氮菌株对燕麦生长的影响各异，大多数菌株明显促进燕麦生长（株高、根长、根表面积和生物量），与本研究结果具有一定的相似性。其中处理F为溶磷菌、联合固氮菌及根瘤菌复合处理，促进效果表现最为优良，尤其是对根系活力的提高作用显著，这与溶磷菌与根瘤菌之间的互作效应是密不可分的。溶磷菌溶解的磷矿粉能作为根瘤菌的磷源，促进其生长繁殖，为植株提供更多的氮素。此外，菌株本身的生理特性、菌株互作效应及接菌方式等因素都可显著影响菌对寄主植物的促生效果。张英等［27］对4株根际促生菌的互作效应研究表明，部分菌株混合后其有效磷增量及分泌IAA量均呈现“1＋1＞2”的加成效应。韩华雯等［28］利用单一促生菌株和菌株组合对紫花苜蓿（Medicagosativa）产量的研究表明，菌株组合效果优于单一菌株。本研究中部分菌株组合后效果也呈现出此趋势，如对株高的影响为组合处理E、F均高于单一接种剂。本研究仅证明接种剂在水溶液难溶性磷条件下能够溶解部分无效态磷、并结合固氮作用提供氮素供植株吸收利用，对自然土壤状况下接种剂的应用有待进一步研究。

接种剂对根系生长可以起到良好的促进作用，主要表现在根长、生物量、根表面积及根体积等形态学变化上，但根系直径较CK相比均有不同程度减小，CK根系直径最大，但其根表面积最小，这也从另一方面说明了根系直径越小其接触面积越大，越有利于对养分和水分的吸收利用，这与王宁和秦艳［29］对三叶鬼针草（Bidenspilosa）接种AM真菌的研究结果一致。一般认为，根系活力能反映根系吸收能力的强弱，其强弱直接影响植株对营养物质的吸收，进而影响地上部的生长发育。冯莉等［30］研究证实，利用荧光假单胞菌处理烟草根系，其根系活力显著提高。本研究除A处理外，其他处理均可提高箭筈豌豆根系活力，以处理F效果最佳。根系活力提高说明根系发达，侧根数及根质量增加，这与上述根系形态的变化相一致。

根系形态特征与植物利用土壤养分的效率密切相关［31］，多数研究证实，低磷胁迫下植物根系会发生适应性变化，如无磷胁迫下大豆根长、根表面积与根体积比低磷及高磷条件下显著提高，但根系直径减小［11］。本研究通过接种溶磷菌，营养液中低磷胁迫下有效磷含量增加，加之箭筈豌豆种子较大，本身含磷量较高，在接种促生菌剂后箭筈豌豆根长、根表面积与根体积明显提高，而根系直径减小，说明微生物对根系形态的影响与低磷胁迫响应机制不同，可能是促生菌剂能增加根系分枝强度［29］。由于多数促生菌都可分泌生长素，而生长素诱导可刺激侧根的产生［32］，因此，也可能与某些植物激素的调控有关。

以往研究关于箭筈豌豆根际微生物的报道较少，并且主要集中在根瘤菌与箭筈豌豆共生效应方面，有关溶磷菌、固氮菌及根瘤菌复合接种剂的研究尚未见报道。本研究对箭筈豌豆根际促生菌筛选及接种剂对其生长的影响进行了较为系统的前期试验，对保障农牧业可持续发展具有重要意义。本试验中菌株的分子生物学鉴定是下一步研究的重点。

4 结论

筛选出4株根际优良促生菌，其中J3－1、J1－15具有较高溶磷量，Y16兼具溶磷、固氮及分泌生长素性能，J3为根瘤菌，4株菌在后期应用中具有较高潜力。

利用筛选的优良促生菌株制备的接种剂对箭筈豌豆地上及根系生长有促进作用，接种剂C及F对箭筈豌豆具有较好的促进作用，有望成为后期研制菌肥的最佳菌株及组合。

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