持续脑缺血后半暗带区星形胶质细胞的转归＊

付学军， 黄巧英， 徐铅辉， 邹良玉， 张 睿， 褚晓凡

暨南大学第二临床学院，深圳市人民医院神经内科，深圳 518020

随着对星形胶质细胞生物学特性及功能的不断认识，星形胶质细胞在脑缺血中的作用及地位日益被人们所重视。正如神经细胞的研究，脑缺血后星形胶质细胞的研究也涉及到细胞保护、生物学功能等方面。其中细胞保护的主要目标就是避免细胞继续死亡，更好地发挥细胞的生物学功能。如何切实干预细胞死亡，达到细胞保护的目的，就需要明确细胞死亡的过程及机制。在既往形态学研究观察到星形胶质细胞存在胀亡的基础上［1－2］，本研究通过对大鼠持续脑缺血后半暗带区星形胶质细胞相关指标Caspase－3、Porimin表达情况的研究，进一步探讨星形胶质细胞在持续缺血状态下的转归。

1 材料与方法

1．1 实验动物及分组

32只雄性SD大鼠（健康清洁级，体重250～300g，鼠龄3～4个月，广东省动物中心提供）分成3组，正常对照组、假手术组和实验组，假手术组及实验组又按照缺血时间（6h及24h）分成2个亚组。正常对照组、假手术组每个亚组各6只大鼠，实验组每个亚组各7只大鼠。正常对照组不做任何处理，假手术组只分离血管不进行线栓。实验组制成左大脑中动脉阻塞模型（middle cerebral artery occlusion，MCAO）。分别于 MCAO后6h、24h进行行为学检测及神经功能评分；然后取脑作组织学检查及免疫荧光检测。

1．2 实验方法

1．2．1 MCAO模型制备 MCAO模型制备采用褚晓凡教授在Zea Longa基础上改良的颈内动脉线栓加环扎法［3］。术前动物禁食12h，但可以自由饮水。10%水合氯醛0．3mL／100g腹腔麻醉。通过使用反馈控制的热垫保持肛温在37．5℃。

1．2．2 神经功能评分 采用 Menzies等［4］描述的方法并做了一些改良进行神经功能评分。0分：无明显改变；1分：向后拖拽尾巴时对侧上肢弯曲；2分：向后拖拽尾巴时对侧前肢抓力减弱；3分：可自发向各方向移动，但向后拖拽尾巴时向对侧转圈；4分：自发向对侧转圈；5分：死亡。

1．2．3 组织学检查 MCAO后6h及24h，动物被再麻醉，经心脏灌注4%多聚甲醛（溶于0．1mol／L PBS溶液）固定。取脑，放入4%多聚甲醛中4℃浸泡6h，然后移到4℃的25%蔗糖中3～4d直至沉底。用25%蔗糖和O．C．T的混合物（2∶1）包埋脑，弃掉大脑前部分2mm，而后恒冷箱行冠状连续切片，片厚20μm，每2mm间隔取1张贴于玻片上，每张玻片共有5片脑组织，分别行Cresyl Violet染色及苏木精－伊红染色（按照Cresyl Violet及苏木精－伊红染色试剂盒方法进行）。苏木精－伊红染色用于观察细胞形态，确定缺血半暗带区。Cresyl Violet染色用于评定造模是否成功并通过Image J软件测量脑梗死体积。为避免脑水肿的影响，采用如下方法计算：梗死体积＝对侧半球体积－同侧半球非梗死区体积；脑肿胀比率＝梗死侧半球体积／对侧半球体积。

1．2．4 免疫荧光检测 从－80℃冰箱中取出切片，回温后，切成厚度为20μm脑片；洗片后［0．1mol／L PBS（pH＝4）洗3次，每次5min］以10%胎羊血清、0．3%TritonX－100、0．1mol／L PBS封闭液，室温摇床封闭60min；应用抗体稀释液（含0．1%TritonX－100、0．1mol／L PBS）稀 释 一 抗 （Caspase－3，Porimin及GFAP），每张切片200μL，4℃过夜。冲洗后应用抗体稀释液稀释荧光第二抗体。室温孵育3h。整个荧光抗体稀释及添加过程需注意避光。冲洗后加入DAPI染色液室温避光作用2min；用免疫荧光洗涤液在室温避光漂洗3次，每次5min；封片后在共聚焦荧光显微镜下观察拍照。分别观察6个视野的平均面积内Caspase－3阳性细胞、Porimin阳性及GFAP阳性细胞并计数。

1．3 统计学方法

2 结果

2．1 实验动物成活情况

实验共选用实验动物32只，成活31只。假手术组6只和MCAO 6h组7只均成活。MCAO 24 h组死亡1只；死亡大鼠解剖后可见颅底大量血凝块，考虑血管破裂导致蛛网膜下腔出血所致。进入统计学分析31只。

2．2 行为学分析

假手术组实验动物在缺血6h和24h神经功能评分均为0分，实验组动物在缺血6h评分中位数4分，四分位间距（QR）为0．75，缺血24h组评分中位数为3分，四分位间距（QR）为1．5分，建模成功。

2．3 脑梗死体积及脑肿胀比率

正常对照组及假手术组各个亚组Cresyl Violet染色未见梗死灶。实验组可见左侧大脑中动脉区域明显梗死灶，提示造模成功。缺血6h脑梗死体积显著小于缺血24h脑梗死体积［（94．8±17．8）mm3vs．（145．1±33．8）mm3，P＜0．01］（图1A）。实验组各亚组大脑半球脑肿胀比率（6h与24h）显著大于假手术组（均P＜0．01）；比较实验组各亚组大脑半球脑肿胀比率发现，缺血6h组脑肿胀比率小于缺血24h组，差异有统计学意义［（1．16±0．09）vs．（1．34±0．13），P＜0．01］（图1B）。

2．4 形态学分析

假手术组：脑切片苏木精－伊红染色未见缺血病灶，细胞形态学与正常对照组比较无明显变化。实验组：脑切片苏木精－伊红染色可见明显缺血灶，非缺血侧未见细胞形态改变，缺血中心区大体观察染色偏淡，组织疏松，与正常组织存在差异，缺血24h尤为明显。缺血6h中心区细胞疏松，可见肿胀的星形胶质细胞；半暗带区细胞水肿，散在肿胀的星形胶质细胞。缺血24h中心区可见大空泡样变化细胞，细胞正常结构消失，星形胶质细胞难以辨认；缺血半暗带区细胞水肿明显，可见有肿胀的星形胶质细胞，缺血中心区和半暗带区细胞形态差别明显。

图1 脑缺血6h和24h脑梗死体积及肿胀比率比较Fig．1 Comparison of the cerebral infarction volume and swelling ratio between 6hand 24hMCAO groups

2．5 免疫荧光检测

正常对照组与假手术组各亚组可见形态正常的GFAP表达阳性细胞，未见Caspase－3表达阳性的细胞（图2A、B）。MCAO后6h，在半暗带区可见较多Caspase－3阳性的细胞，偶见突触消失且胞体肿胀的Caspase－3与GFAP、DAPI三标阳性细胞（图2C）；MCAO 后24h，半暗带区少见 Caspase－3与GFAP、DAPI三标细胞（图2D）。正常对照组与假手术组各亚组可见形态正常的GFAP表达阳性细胞，未见Porimin表达阳性的细胞（图3A、B）。MCAO后6h，大脑中动脉栓塞中心区可见大量破碎的GFAP阳性细胞，半暗带区偶见GFAP阳性细胞突触消失，胞体明显肿胀，未见Porimin与GFAP、DAPI三标阳性细胞（图3C）；MCAO后24h，中心区细胞大多破碎，半暗带区可见较多Porimin与GFAP、DAPI三标阳性肿胀细胞（图3D）。

图2 MCAO后半暗带区Caspase－3与GFAP的表达（×40）Fig．2 Expression of Caspase－3and GFAP in the penumbra after MCAO（×40）

图3 MCAO后半暗带区Porimin与GFAP的表达（×40）Fig．3 Expression of porimin and GFAP in the penumbra after MCAO（×40）

比较实验组在MCAO后24h半暗带区Caspase－3与GFAP、DAPI三标阳性细胞数目与Porimin与GFAP、DAPI三标阳性细胞数目发现：Porimin与GFAP、DAPI三标阳性细胞数目显著高于Caspase－3与GFAP、DAPI三标阳性细胞数目［（9．72±1．95）vs．（2．36±1．08），P＜0．01］。

3 讨论

星形胶质细胞广泛存在于大脑灰质及白质中，在神经系统的发育、突触传递、神经组织修复与再生、神经免疫及多种神经疾病的病理机制等方面，都起着十分重要的作用。正是了解到星形胶质细胞对于神经细胞具有支持隔离、营养支持、信号传递等作用，我们才逐步认识到在缺血性脑血管疾病中对星形胶质细胞的保护可能对减少神经细胞损伤具有重要意义。围绕在神经细胞周围的星形胶质细胞将比神经细胞更早期、更直接受到损害，而星形胶质细胞保护作用破坏后才是神经细胞损伤的开始。如果星形胶质细胞能早期获得保护，其结果将是神经细胞有更多的机会获得持续支持、营养及保护作用，从而减少缺血损伤后神经细胞的继发损害。了解损伤后细胞死亡的转归过程是寻找挽救细胞手段的基础。只有明确星形胶质细胞缺血损伤后的转归过程才能更好地研究探讨脑细胞保护等问题。

在前期的研究中，我们通过形态学的观察提出了星形胶质细胞在脑缺血过程中存在胀亡的死亡形式。当然也有研究认为其在缺血性损伤后是呈凋亡的死亡形式［5－6］。其实，胀亡作为完全缺血或化学毒性损害后的细胞死亡形式很早就已经被认识。胀亡（oncosis）主要表现为细胞受损后体积扩大，膜通透性增加、完整性破坏，DNA裂解成为非特异性片段，最后细胞溶解，胞质漏出并伴有周围组织炎症反应。目前对于心肌细胞、肾细胞缺血后胀亡发生的相关研究一直在进行［7－8］。随着胀亡相关研究的进展，有结果提示凋亡、胀亡可能共存于细胞死亡的早期，在一定条件下沿着不同方向发展，从而出现了不同的细胞死亡结果［7－11］。随着实验观察指标的不断发展和进步，使得我们从单纯形态学上对胀亡的认识，逐步转化到与生物化学指标相结合的途径，也更能从客观的层面深入地探讨既往形态学方面的认识是否正确。本研究正是将DAPI、GFAP与Caspase－3及Porimin相结合，进一步评估脑缺血后半暗带区星形胶质细胞的转归情况。

通过对组织标本Cresyl Violet染色，我们可以观察到实验组均形成了明确的左侧大脑中动脉梗死病灶。通过对脑梗死体积及脑肿胀比率的计算说明在缺血后脑组织水肿确实存在，而且在24h内随着时间延长而水肿逐渐加重。而苏木精－伊红染色也提示梗死区存在细胞肿胀及细胞间水肿情况。一般认为缺血后脑组织水肿包括细胞源性和血管源性。通过MCAO后24h及6h脑组织肿胀率对比情况及苏木精－伊红染色细胞形态的进一步观察也发现，持续缺血后脑组织水肿可能是两种水肿机制共存：早期以细胞源性水肿为主，随着血脑屏障的逐步破坏过渡到以血管源性水肿为主。整个研究中我们可以肯定一点，持续性脑缺血后的确存在细胞肿胀的过程，其中又以在半暗带区细胞肿胀为多见。

Caspases是一组天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶。该家族蛋白酶的级联活化是细胞凋亡程序的主要运行方式。Caspase－3被认为与凋亡关系最为密切，它是细胞凋亡的关键分子，激活的Caspase－3能使许多与细胞结构、细胞周期及DNA修复等有关的蛋白或激酶失活［12］。Caspase－3的表达能反映细胞是否启动凋亡程序。本研究中我们可以看到在脑缺血半暗带区可见较多Caspase－3阳性的细胞，然而DAPI、GFAP和Caspase－3三重标记阳性的细胞数量较少（图3C），这提示我们：脑缺血6h后半暗带区存在凋亡的细胞，但更多走凋亡途径的是非星形胶质细胞，其中包括小胶质细胞及神经元。而缺血24h半暗带区三重标记阳性细胞不明显，这可能提示星形胶质细胞以凋亡转归的可能比较小。当然三重标记阳性细胞不明显是否与缺血程度有关，尚有待不断研究进一步观察。

Porimin由189个氨基酸残基构成，与角质蛋白形成相关，是胀亡前期的细胞表面受体，可以引起细胞膜损伤。从图3B中，我们可以看出，在MCAO后6h组DAPI、GFAP与Porimin阳性表达细胞不多，而24h后半暗带区存在着一定数量的DAPI、GFAP和Porimin三重标记的阳性细胞，这提示星形胶质细胞在半暗带区存在以细胞膜损伤致细胞肿胀死亡的细胞死亡过程，也就是存在胀亡的可能。随着缺血时间延长，三标阳性细胞的增加可能与缺血后细胞的损伤程度相关。

我们通过对比Caspase－3、GFAP和DAPI三重标记的与Porimin、GFAP和DAPI三重标记的细胞在半暗带区的表达情况，发现GFAP／Porimin在同样视野下占细胞比例要多于GFAP／Caspase－3细胞的比例。因此我们考虑星形胶质细胞在缺血半暗带区的细胞死亡形式可能以胀亡为主，但同时也有部分星形胶质细胞在一定条件下沿着凋亡途径走向死亡，其中具体的机制差别有待于进一步研究。

通过本次研究，我们认识到随着脑缺血时间的延长，半暗带区星形胶质细胞损伤逐渐加重。而缺血半暗带区星形胶质细胞死亡多以细胞膜破坏、细胞肿胀为特征，即以胀亡形式为主。星形胶质细胞胀亡这一转归也许与其中细胞膜上的Porimin受体激活有关。

［1］ 付学军，褚晓凡，亓传洁，等．胀亡——持续性局灶脑缺血星形胶质细胞的死亡方式［J］．中华神经医学杂志，2005，4（10）：979－982．

［2］ Chu X，Fu X，Zou L，et al．Oncosis，the possible cell death pathway in astrocytes after focal cerebral ischemia［J］．Brain Res，2007，29（1149）：157－164．

［3］ Chu X，Qi C，Zou L，et al．Intraluminal suture occlusion and ligation of the distal branch of internal carotid artery：an improved rat model of focal cerebral ischemia－reperfusion［J］．J Neurosci Methods，2008，168（1）：1－7．

［4］ Menzies S A，Hoff J T，Betz A L．Middle cerebral artery oc－clusion in rats：a neurological and pathological evaluation of a reproducible model［J］．Neurosurgery，1992，31（1）：100－106．

［5］ Li Y，Xu N，Cai L，et al．NDRG2is a novel p53－associated regulator of apoptosis in C6－originated astrocytes exposed to oxygen－glucose deprivation［J］．PLoS One，2013，8（2）：e57130．

［6］ Wang N，Zhang Y，Wu L，et al．Puerarin protected the brain from cerebral ischemia injury via astrocyte apoptosis inhibition［J］．Neuropharmacology，2013，12（79）：282－289．

［7］ Majno G，Joris I．Apoptosis，oncosis and necrosis．An overview of cell death［J］．Am J Pathol，1995，146（1）：3－15．

［8］ Majno G，Joris I．Cells tissues and disease－principles of general pathology［M］．2nd ed．New York：Oxford University Press，2004：186－245．

［9］ Buja L M．Myocardial ischemia and reperfusion injury［J］．Cardiovasc Pathol，2005，14（4）：170－175．

［10］ Buja L M，Vela D．Cardiomyocyte death and renewal in the normal and diseasedheart［J］．Cardiovasc Pathol，2008，17（6）：349－374．

［11］ Buja L M，Weerasinghe P．Unresolved issues in myocardial reperfusion injury［J］．Cardiovasc Pathol，2010，19（1）：29－35．

［12］ 舒榕，刘冬玲，王强瑞．芬太尼对大鼠脑缺血再灌注损伤后大脑皮质bcl－2和Caspase－3表达的影响［J］．华中科技大学学报：医学版，2012，41（1）：72－75．