不同产地山茱萸中4种活性成分含量的HPLC分析

刘艳妮，李慧敏，徐 融，韦春桃，康杰芳

（陕西师范大学药用资源与天然药物化学教育部重点实验室西北濒危药材资源开发国家工程实验室，陕西 西安 710062）

中药山茱萸为山茱萸科（Cornaceae）植物山茱萸（Cornus of ficinalis Sieb.et Zucc.）的干燥成熟果肉，具有补益肝肾、收涩固脱的功效［1－2］；主产河南、浙江和陕西，四川、安徽和山东也有栽培［3］。山茱萸还具有调节免疫、降血糖、抗氧化及抗癌等作用，包含有机酸及其酯类、五环三萜及其酯类、环烯醚萜类、鞣质、维生素、氨基酸和矿物质等活性成分［4－7］，其中，马钱苷是山茱萸药材检测的标准成分［2］，没食子酸具有抗肿瘤作用［8］，5－羟甲基糠醛（5－HMF，5－hydroxymethylfurfural）有保护肝肾、抗氧化等药理活性［9－10］，原儿茶酸具有抗菌及抗肿瘤作用［11］，因此，这4种成分可作为山茱萸药材和饮片质量控制的指标成分。目前，对山茱萸有效成分含量的测定多集中于少数成分［12－13］，并不能从整体上反映其内在质量［14］。

作者采用HPLC－DAD法对来源于不同产地的山茱萸果肉中前述4种活性成分的含量进行测定，以期建立山茱萸有效成分的多组分高效液相检测方法，为山茱萸药材质量的整体评价提供依据，也为山茱萸的优种选育提供基础数据。

1 材料和方法

1.1 材料

供试鲜果样品分别采自陕西、浙江、河南和安徽，其中，1至3号样品于2011年10月16日采自陕西丹凤日月镇；4和5号样品于2011年10月17日采自陕西丹凤流岭；6至10号样品于2011年10月4日采自浙江淳安瑶山乡；11至14号样品于2011年10月22日采自河南西峡二郎坪乡；15号样品于2011年10月22日采自河南西峡太平镇；16和17号样品于2011年10月10日采自安徽歙县杞梓里镇；18至20号样品于2011年10月10日采自安徽歙县金川乡。样品均经陕西师范大学生命科学学院植物学教研室鉴定为山茱萸成熟果肉。鲜果肉于50℃烘干、粉碎后过40目筛，于4℃干燥保存。

LC－2010A HT型高效液相色谱仪（日本 SHIMADZU公司）、超纯水仪（美国Millipore公司）、Centrifuge5804R冷冻台式离心机（德国 Eppendorf公司）、FA2004N型电子分析天平（上海天平仪器总厂）和KQ5200型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；乙腈和甲酸均为色谱纯、水为超纯水、甲醇为分析纯。对照品为没食子酸（中国药品生物制品检定所，批号110831－200302，纯度≥90.1％）、5－HMF（中国药品生物制品检定所，批号111626－200503，纯度≥98％）、原儿茶酸（上海一林生物科技有限公司，批号0424121，纯度≥98％）和马钱苷（成都曼斯特生物科技有限公司，批号 MUST－11052813，纯度≥98％）。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件 Phenoemenex C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm）。流动相A为体积分数0.1％甲酸溶液、B为乙腈；梯度洗脱：0～15 min，2％B；15～50 min，4％～16％B；50～57 min，16％～18％B；57～67min，18％～90％B；67～77min，90％～2％B。柱温30℃；流速1.0 mL·min－1；二极管阵列检测器，检测波长分别为240、260、265和280 nm；进样量10μL。

1.2.2 对照品溶液制备及标准曲线绘制 分别精密称取马钱苷、没食子酸、5－HMF和原儿茶酸对照品1.00mg，加入体积分数80％甲醇溶解并定容至1 mL，0.22μm微孔滤膜过滤；分别稀释2、100、1000和20倍后再用0.22μm微孔滤膜过滤，分别获得0.50 mg·mL－1马钱苷、0.05 mg·mL－1原儿茶酸、0.01 mg·mL－1没食子酸和0.001 mg·m L－15－HMF对照品溶液。分别精密吸取马钱苷对照品溶液1、3、4、5、6和10μL，没食子酸对照品溶液1、2、4、10、20和40μL，5－HMF对照品溶液1、2、4、8、10和20μL，原儿茶酸对照品溶液1、2、4、6、10和20 μL，按照上述色谱条件依次进样分析。

以峰面积值为纵坐标y、对照品进样质量为横坐标x绘制标准曲线。马钱苷对照品的回归方程为y=（3.2727×106）x+（2.1486×104）（r=0.9990），线性范围0.500～5.000μg；没食子酸对照品的回归方程为y=（1.5467×107）x+（3.7925×104）（r=0.9994），线性范围0.010～0.400μg；5－HMF对照品的回归方程为y=（9.1309×106）x+（3.4545×102）（r=0.9999），线性范围0.001～0.020μg；原儿茶酸对照品的回归方程为y=（5.4320×105）x+（2.4671×103）（r=0.9998），线性范围0.050～1.500μg。

1.2.3 供试样品溶液制备及色谱分析 精密称取果肉粉末1.00 g，加入25mL体积分数80％甲醇，称量后超声提取（功率600W、频率40 kHz）45 min，用体积分数80％甲醇补足减失的质量；在室温下于8000 r·min－1离心8 min，上清液用0.22 μm微孔滤膜过滤，滤液即为供试样品溶液，按照上述色谱条件进样分析，进样量10μL。

1.3 方法学考察

1.3.1 精密度实验 精密吸取2号供试样液10μL，按照上述色谱条件连续进样6次，马钱苷、没食子酸、5－HMF和原儿茶酸峰面积值的RSD值分别为1.57％、1.97％、1.30％和1.93％，表明仪器精密度良好。

1.3.2 重现性实验 称取2号样品粉末6份，每份1.00 g，按上述方法制备供试样液并按照上述色谱条件进样测定，马钱苷、没食子酸、5－HMF和原儿茶酸峰面积值的RSD值分别为1.33％、1.79％、2.23％和1.89％，表明仪器重现性良好。

1.3.3 稳定性实验 取2号供试样品溶液，按照上述色谱条件分别于0、2、4、8、12和24 h进样测定，马钱苷、原儿茶酸、没食子酸和5－HMF峰面积值的RSD值分别为0.73％、1.22％、1.15％和1.65％，表明样品溶液在24 h内稳定性良好。

1.3.4 加样回收率实验 称取2号样品粉末6份，每份1.000 g，分别准确加入对照品马钱苷、没食子酸、5－HMF和原儿茶酸5.667、0.069、0.014和0.456 mg，按上述方法制备供试样液并进样分析，计算加样回收率。马钱苷、没食子酸、5－HMF和原儿茶酸的加样回收率分别为98.56％、100.93％、101.17％和101.40％，RSD值分别为2.01％、2.76％、1.93％和1.34％。

2 结果和分析

来源于4个省份7个产地的山茱萸果肉中4种活性成分含量的测定结果见表1。由表1可见：不同产地样品中4种成分的含量均有一定差异。总体上看，马钱苷含量在来源于安徽歙县的样品中最高、在来源于浙江淳安县的样品中最低；没食子酸含量在来源于陕西丹凤县的样品中最高、在来源于河南西峡县的样品中最低；5－HMF和原儿茶酸含量均在来源于浙江淳安县的样品中最高、在来源于河南西峡县的样品中最低。另外，即使是来源于同一产地的样品，其4种成分的含量也有明显差异，例如18、19和20号样品均来源于安徽歙县金川乡，但20号样品的马钱苷含量在20个样品中最高（7.7624 mg·g－1），而19号样品的马钱苷含量在20个样品中几乎最低（2.7771 mg·g－1），前者为后者的2.8倍。

由表1还可见：4种成分中，马钱苷含量最高（2.6329～7.7624 mg·g－1），没食子酸（0.0273～0.3609 mg·g－1）和原儿茶酸（0.1581～0.8374 mg·g－1）含量居中，5－HMF的含量最低（0.0039～0.0263 mg·g－1）。

3 讨论和结论

由上述测定结果可以看出：不同产地山茱萸果肉中4种活性成分的含量差异较大，浙江淳安产山茱萸果肉中马钱苷含量均未达到0.6％［2］的标准，说明产地的环境因素（包括温度、湿度、土壤、光照时间和海拔等）对山茱萸果肉中活性成分的含量有较大影响。而同一产地不同个体间同一成分的含量也有较大差异，例如采自浙江淳安的6个样品没食子酸含量相差近10倍。因此，在评价及考察山茱萸药材质量时应综合考虑其活性成分含量及产区等因素。

本研究采用高效液相二极管阵列检测法（HPLC－DAD），结合体积分数0.1％甲酸－乙腈流动相梯度洗脱，在67min内实现1次进样可在不同波长下同时测定4种成分的含量，色谱峰峰形好、分离度较高，能够准确测定4种活性成分的含量。本方法操作简单，精密度、重现性和稳定性良好，为山茱萸药材有效成分的质量控制和药效评价奠定了实验基础。

表1 来源于不同产地的山茱萸果肉中4种活性成分的含量（±SD，n=3）Table1 Content of four active components in flesh of Cornus of ficinalis Sieb.et Zucc.from different locations（±SD，n=3）

表1 来源于不同产地的山茱萸果肉中4种活性成分的含量（±SD，n=3）Table1 Content of four active components in flesh of Cornus of ficinalis Sieb.et Zucc.from different locations（±SD，n=3）

1）1－3：采自陕西丹凤日月镇Collected from Riyue Town in Danfeng County of Shaanxi Province；4－5：采自陕西丹凤流岭 Collected from Liuling in Danfeng County of Shaanxi Province；6－10：采自浙江淳安瑶山乡Collected from Yaoshan Village in Chun’an County of Zhejiang Province；11－14：采自河南西峡二郎坪乡Collected from Erlangping Village in Xixia County of He’nan Province；15：采自河南西峡太平镇Collected from Taiping Town in Xixia County of He’nan Province；16－17：采自安徽歙县杞梓里镇Collected from Qizili Town in Shexian County of Anhui Province；18－20：采自安徽歙县金川乡Collected from Jinchuan Village in Shexian County of Anhui Province.

样号1） No. of sample1）含量/mg·g－1 Content马钱苷 Loganin 没食子酸 Gallic acid 5-HMF 原儿茶酸 Protocatechuic acid16.8964±0.0512 0.0316±0.0003 0.0091±0.0013 0.2305±0.062325.6666±0.0503 0.0304±0.0002 0.0116±0.0012 0.2784±0.031533.2400±0.0261 0.1025±0.0005 0.0194±0.0006 0.2316±0.002942.6329±0.0364 0.3609±0.0031 0.0085±0.0008 0.6485±0.140453.9356±0.0237 0.2874±0.0052 0.0079±0.0009 0.5572±0.069662.8784±0.0232 0.1127±0.0016 0.0194±0.0007 0.8374±0.016572.9783±0.0733 0.0428±0.0014 0.0245±0.0026 0.6473±0.139482.8480±0.1413 0.0273±0.0025 0.0179±0.0024 0.5097±0.072293.7245±0.0082 0.2985±0.0005 0.0263±0.0005 0.7917±0.020910 4.2709±0.0635 0.1583±0.0036 0.0104±0.0019 0.5125±0.018111 5.5048±0.0329 0.0611±0.0024 0.0065±0.0018 0.4216±0.046312 6.8960±0.0427 0.0623±0.0017 0.0039±0.0007 0.3692±0.063213 4.7630±0.0652 0.0514±0.0019 0.0074±0.0006 0.2575±0.017514 2.9239±0.0301 0.0442±0.0021 0.0082±0.0019 0.2439±0.028715 5.5040±0.0431 0.0373±0.0035 0.0076±0.0007 0.2074±0.002416 6.1432±0.0823 0.0789±0.0003 0.0058±0.0016 0.5072±0.004517 7.1692±0.0594 0.0784±0.0022 0.0055±0.0013 0.3408±0.014518 5.6283±0.0523 0.1659±0.0192 0.0057±0.0018 0.4026±0.001919 2.7771±0.0634 0.0715±0.0021 0.0052±0.0015 0.1581±0.007220 7.7624±0.0602 0.2652±0.0047 0.0074±0.0013 0.2572±0.0095

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