加速溶剂萃取–液相色谱法测定五灵脂药材中原儿茶酸的含量*

巩志国，苏敏，王静静，员丽娟，李世雨，季新成，朱建民

（新疆出入境检验检疫局技术中心，乌鲁木齐 830063）

五灵脂（Faeces Trogopterori）是哺乳纲鼯鼠科动物复齿鼯鼠（Trogopterus xanthipes Milne-Edwards）的干燥粪便，分为灵脂米和灵脂块两种。灵脂米即复齿鼯鼠的干燥粪便，灵脂块是其粪便与尿液的混合物夹以少量砂石干燥凝结而成［1］。五灵脂具有行血散瘀止痛的功效，用于治疗产后子宫复旧不全、毒蛇咬伤、胃脘痛经久不愈等［2］。原儿茶酸（3，4-二羟苯甲酸，Protocatechunic acid）具有增加冠脉血流、缓解心绞痛的作用，是五灵脂的重要活性成分单体之一，是一种水溶性酚酸成分，具有显著降低心肌耗氧量、提高心肌耐氧能力、减慢心率等药理作用，并且对乙肝病毒的脱氧核糖核酸（DNA）复制具有较强的抑制作用［3］。目前五灵脂中原儿茶酸的测定方法主要是液相色谱法［4–5］和分光光度法［6］；样品前处理主要使用超声提取和水浴加热提取两种方式，缺点是耗时长，试剂用量大、挥发多。笔者采用加速溶剂萃取法（ASE），具有萃取时间短、溶剂用量少和萃取效率高等突出优点。该法的研究将为控制五灵脂药材的质量提供参考。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

液相色谱仪：Waters 2695 型，配有紫外检测器，美国沃特斯公司；

涡旋仪：MS3 型，德国IKA 公司；

超声仪：SK8200LH 型，上海科导超声仪器有限公司；

高纯水发生器：Milli-Q Ⅱ型，美国密理博公司；

离心机：T–124 型，瑞士KONTRON 公司；

旋转蒸发仪：RE–52AA 型，上海亚荣生化仪器厂；

加速溶剂萃取仪（ASE）：ASE200 型，美国戴安公司；

原儿茶酸标准品：东京化学工业公司；

甲醇、乙腈：色谱纯，美国Fisher 公司；

再生纤维素滤膜：0.2 μm，美国安捷伦公司；

五灵脂样品：市售和蒙古国进口样品；

其它试剂均为优级纯；

实验用水为二次净化水。

1.2 溶液配制

1.2.1 标准溶液

准确称取适量原儿茶酸标准品，用甲醇配成100 mg／L 的标准储备液，储存于–18℃冰箱，保存期18 个月。根据实验需要，用甲醇稀释标准储备液，配成适当浓度的标准工作溶液。

1.2.2 样品提取液

750 mL 无水乙醇和250 mL 水混合。

1.3 液相色谱条件

液相色谱柱：Diamosil C18（4.6 mm×250 mm，5.0 μm，迪马科技公司）；流动相：甲醇（A）和0.5%的乙酸水溶液（B）；梯度洗脱程序：0～10 min 时85%～60% 的A，10～15 min 时60%～15% 的A，15～22 min 时15% 的A，22～25 min 时15%～85%的A，25～30 min 时85%的A；流速：1.0 mL／min；柱温：35℃；分析波长：260 nm。

1.4 样品处理

称取1.0 g 样品，添加0.2 g 硅藻土，混匀后置于11 mL 加速溶剂萃取池中（下部预先添加少量海沙），上部添加海沙至平，拧紧萃取池冒，放入加速溶剂萃取池盘中。ASE 条件：溶剂为乙醇–水（体积比75∶25），温度为100℃，压力为15 MPa，预热时间为5.0 min，静态萃取时间为10.0 min，循环次数为3 次。接收池溶液旋转蒸发至约5 mL，用提取液定容至5.0 mL，过0.2 μm 的再生纤维素膜，上液相色谱测定。

1.5 色谱图

在1.3 的色谱条件下，原儿茶酸标准品的色谱图见图1。

2 结果与讨论

2.1 色谱柱和流动相的选择

原儿茶酸为白色至褐色结晶性粉末，在空气中变色。其结构为苯环上含有两个羟基和一个羧基。原儿茶酸的属于极性稍强物质，在反相色谱柱上有保留。参考待测物的性质和相关文献［7］，选择反相C18色谱柱分离待测物。通过比较甲醇和酸性（乙酸和磷酸）水溶液，乙腈和酸性（乙酸和磷酸）水溶液，依据基线噪音的高低和目标物与杂质的分离度进行选择。实验结果表明，甲醇和0.5%乙酸的水溶液作为流动相，噪音较低，分离度较好。

2.2 提取条件的选择

原儿茶酸常用的提取液有乙醇水溶液和甲醇水溶液。由于甲醇毒性较大，因此选择乙醇和水的溶液提取。

加速溶剂萃取技术是近年来发展起来的一种在高温（室温～200℃）、高压（0.1～20 MPa）条件下快速提取固体或半固体样品的样品前处理方法，与常用的索氏提取、超声提取、微波萃取技术等方法相比具有节省溶剂、快速、健康环保、自动化程度高等优点。该技术广泛应用环境分析、农产品安全、制药、天然产物提取和能源等诸多领域，适合色谱分析样品预处理。

笔者依据待测物质和提取溶剂的性质选择性试验了加速溶剂提取的温度、压力、提取时间和循环次数等条件，并参照色谱上的保留行为和其含量变化选择条件，实验最终确定的提取条件：温度100℃，压力15 MPa，预热5 min，静态提取10 min，循环次数为3 次。

2.3 工作曲线方程、检出限及定量限

用原儿茶酸的标准储备液配制不同浓度的标准工作溶液，原儿茶酸的标准工作溶液的浓度分别为0.1，0.3，0.5，1.0，5.0，10.0 mg／L。在1.3 色谱条件下分别进行测定，以色谱峰面积(Y)为纵坐标，以原儿茶酸的质量浓度(X)为横坐标进行线性回归，得回归方程为Y=0.045X＋0.029，相关系数r=0.999 8，线性范围为0.1～10.0 mg／L。以3 倍信噪比计算得检出限为0.5 mg／kg，以10 倍信噪比计算定量限为1.0 mg／kg。

2.4 回收率和精密度试验

利用五灵脂样品进行3 个添加水平的回收试验，每个水平重复5 次。原儿茶酸的添加量是1.0，2.0，5.0 mg／kg 3 个水平，回收率和精密度的试验结果见表1。由表1 可知，该方法有较好的精密度和准确度，可以满足五灵脂中原儿茶酸含量检测需要。

表1 五灵脂中的回收率及精密度结果（n=5）

2.5 样品测定

将本方法用于实验室中25 份五灵脂样品的分析，对样品中的原儿茶酸含量进行测定，最终定容体积依据其含量水平稀释到线性范围内，根据化合物的色谱保留时间和光谱图来鉴别样品。所测定样品中原儿茶酸的含量水平为0.01%～0.1%范围内。

3 结语

采用加速溶剂萃取仪来提取五灵脂样品中原儿茶酸，乙醇水溶液作为溶剂，ASE 的提取效率高，省时又经济。本方法不仅可用于五灵脂中原儿茶酸的含量测定，还可以测定其它成分的含量，对药材中活性物质的测定提供了参考。

［1］ 唐绪刚，黄文权.五灵脂药理及临床应用概述［J］.中国中医急症，2008，1(17): 101–102.

［2］ 杨东明，苏世文，李铣，等.五灵脂活性成分的研究［J］.药学学报，1987，22(10):756–760.

［3］ 朱翔宇，杨莲菊，李春.HPLC 测定五灵脂中原儿茶酸含量［J］.中国实验方剂学杂志，2010，6(16): 71–73.

［4］ 焦玉，王荣荣，史超，等.HPLC 法同时测定中药五灵脂中3 种成分的含量［J］.沈阳药科大学学报，2010，7(27): 574–578.

［5］ 朱翔宇.五灵脂化学成分与质量控制标准研究［D］.西南交通大学硕士毕业论文，2008，5.

［6］ 陈月开，王美素.五灵脂活性成分单体原儿茶酸的分析测定［J］.山西大学学报（自然科学版），2000，23(3): 260–262.

［7］ 陈征，李文莉，童珂.狗脊饮片不同炮制品中原儿茶酸的含量测定［J］.湖南中医药大学学报，2011，9(31): 38–40.