LC–MS／MS 法测定动物性食品中万古霉素残留*

蒋玉平，卞永东，王德祥，汤勇，黄传国

（盐城市产品质量监督检验所，江苏盐城 224005）

万古霉素属于万古霉素类抗生素，是糖肽类化合物，其药力较强，在其它抗生素对病菌无效时会被使用，但它有严重耳毒性及肾毒性。近年来，由于万古霉素在畜禽和水产品养殖中的滥用，直接影响了以动物为原料的食品的质量安全。随着动物性食品需求的急剧增长，抗生素类药物的不合理使用和滥用，以及不遵守休药期等多种原因所导致的动物性食品中药物残留问题不断增多，对公众健康的潜在危害日趋严重［1］。

目前，国内外还没有制定动物性食品中万古霉素药物检测的方法标准。文献报道的检测万古霉素的方法仅有高效液相色谱法［2］。液相色谱的灵敏度低、定性不准确，而液相色谱–质谱联用技术可显著提高检测的准确度、灵敏度，可提供丰富的结构信息，具有良好的应用前景。为此笔者建立快速高效检测万古霉素的液质联用方法，该方法具有操作简单、快速，精密度好，准确度高的优点。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

串联三重四级杆液质联用仪：6410 型，美国安捷伦公司；

氮吹仪：HGC–12A 型，天津市威仪科技发展有限公司；

去离子水发生器：Milli Q 型，美国Millipore 公司；

电子天平：CP225D 型，最小分度值0.01 mg，德国赛多利斯公司；

HSE 固相萃取仪：天津市恒奥科技发展有限公司；

固相萃取小柱：Oasis HLB 型，颗粒度30μm，美国Waters 公司；

匀浆机：FS–1 型，江苏金坛市荣华实验仪器厂；

冷冻台式高速离心机：美国Thermo 公司；

多功能食品粉碎机：SG250A 型，上海艺华电器厂；

水浴恒温振荡器：SHA–C 型，江苏金坛市金城国胜实验仪器厂；

万古霉素标准品：纯度不低于96 %，德国Dr.E公司；

甲醇、乙腈：色谱纯；

甲酸、乙酸、乙酸铵：优级纯；

实验用水为自制超纯水。

1.2 仪器分析条件

1.2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Eclipse plusC18(100 mm ×2.1 mm，1.8 μm)；流动相：水(A)– 乙腈(B)；流速：0.4 mL／min；梯度：0～0.5 min 5%B，0.50～2.0 min 5%～30 %B，2.0～2.5 min 30%～90%B，2.5～3.0 min 90%B；后 运 行 时 间(post time)： 5 min；柱 温：40℃；进样量：5 μL。

1.2.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：MRM 多重反应检测；气体温度：350℃，气体流速：10 L／mL；雾化器压力：310.3 kPa(45 psi);毛细管电压：3 500 V；定性离子对(m／z)：724.9／99.8，724.9／144；定量离子对(m／z)：724.9／99.8；碎裂电压：120 V；碰撞能量分别分30 V（m／z：724.9／99.8），6 V（m／z：724.9／144）。

1.3 溶液配制

万古霉素标准储备液：1 g／L，精密称取万古霉素标准品适量，用甲醇–水（体积比5∶95）配制而成，于–20℃冰箱中保存。

万古霉素标准溶液：吸取适量万古霉素标准储备液，稀释为10 mg／L 的标准中间溶液。吸取适量标准中间溶液，用与试样基质相应的空白样品提取液配制成1～500 μg／L 基质标准工作溶液，使用前配制。

磷酸盐缓冲溶液：称取67.7 g 磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）和1.5 g 磷酸二氢钾（KH2PO4），用水定容至1 000 mL，配制成0.2 mol／L pH8 的磷酸盐缓冲液。

1.4 样品前处理

1.4.1 提取

准确称取5 g（精确至0.01 g）样品于50 mL离心管中，加入磷酸盐缓冲溶液20 mL，匀浆器中高速匀浆提取2 min，超声提取10 min，重复提取两次，合并提取液，以4 000 r／min 离心10 min，滤纸过滤，待净化。

1.4.2 净化

使用前将HLB 固相萃取小柱依次过3 mL 甲醇、3 mL 水、3 mL 0.2 mol／L 磷酸盐缓冲溶液活化，将待净化上清液全部过柱，弃去滤液，用3 mL磷酸盐缓冲液、3 mL 水洗涤，最后用5 mL 乙腈洗脱并收集；洗脱液在45℃水浴中氮吹浓缩至近干，用流动相[水–乙腈(体积比为95∶5）]定容至1 mL，旋涡混合后过0.22 μm 滤膜，滤液供HPLC–MS／MS 测定［3］。

2 结果与讨论

2.1 MS／MS 条件优化

根据欧盟EC657［4］指令规定，对于液–质联用方法，一个母离子（1.0 识别点）加两个特征子离子（2×1.5 识别点）可以满足对一个被分析物4 个识别点的定性确证的要求。表1 列出了万古霉素的母离子、子离子等主要参数。

表1 主要质谱参数及色谱保留时间

2.2 液相色谱条件优化

对甲醇和乙腈两种溶剂作为有机相进行了比较试验。结果显示，乙腈更有利于去溶剂化，且万古霉素的响应值高，所以选择乙腈作为流动相中的有机相。

水相分别用水、0.1%甲酸水溶液、5 mmol／L甲酸铵溶液、0.1%甲酸、5 mmol／L 甲酸铵溶液，有机相用乙腈，梯度洗脱。综合考虑峰形、分离度和响应值，选用水–乙腈为流动相。

2.3 样品前处理条件

动物性食品基质差异比较大，选取牛奶、猪肉作为典型基质进行加标试验。提取方法主要为缓冲液提取、固相萃取净化后再进样分析。比较了磷酸盐缓冲溶液和Na2EDTA–Mcllvaine (0.1 mol／L，pH4.0)缓冲溶液［5］的提取效果。实验发现前者能较好地提取出被测组分，且回收率较高，故选择磷酸盐缓冲溶液为提取液。

2.4 线性关系、检出限和定量限

精密称取万古霉素标准品适量，用甲醇–水(体积比5∶95)稀释定容，配制成1 g/L 标准储备液。依次吸取适量标准储备液配制成浓度分别为1，10，50，250，500 μg/L 系列标准溶液。

在选定的条件下对上述系列标准溶液进行测定，以目标化合物峰面积（Y）和对应标准溶液的浓度（X）进行线性回归，得线性回归方程为Y=947.342 45X–1 549.870 1，相关系数r2=0.998，线性范围为1～500 μg／L。以信噪比S／N＝3 计算方法的检出限，以S／N＝10 计算方法的定量限，经计算得检出限为2 μg／kg，定量限为7 μg／kg。万古霉素总离子流图及其MRM 定量离子提取色谱图见图1、图2。

2.5 回收率、精密度试验

在牛奶、猪肉基质空白样品中添加10，50，100 μg／mL 3 个水平万古霉素标准溶液进行加标回收试验，结果见表3。由表3 可知，3 个水平加标回收率为84.8%～118.2%，相对标准偏差为2.2%～7.2%。由此可见本方法的精密度和准确度良好。加标样品中残留物的特征离子丰度比与标准物的特征离子丰度比之间的偏差在20%以内，满足质谱方法的确证要求。

表3 回收率和精密度试验结果(n=5)

3 结语

建立了动物性食品中万古霉素残留的液质联用测定方法。该法重现性良好，操作简便、结果准确，能满足日常分析检验的需要，有利于提高动物性食品中抗生素残留的检测水平。

［1］ 李俊锁，邱月明，王超.兽药残留分析［M］.上海：上海科学技术出版社，2003.

［2］ 丰嘉驹，顾嘉钦.高效液相色谱法测定万古霉素血药浓度［J］.中国临床药学杂志，2000(2): 107–108.

［3］ 赵华，卞永东，王德祥，等.液相色谱–串联质谱法测定动物性食品中20 种抗生素类药物残留［J］.化学分析计量，2011，20(1):20–23.

［4］ Commission of the European Communities. Commission decision of 12 August 2002 implementing council directive 96/23/EC concerningthe performance of analytical methods and the interpretation of results[J]. Official Journal of the European Communities,2002, L221: 8–36.

［5］ GB／T 20755–2006 畜禽肉中九种青霉素类药物残留量的测定液相色谱–串联质谱法［M］.