DNS法测定红松松塔多糖含量的研究

冯雪，张曜武，曹炳星，王薇薇

（青岛科技大学化工学院，山东 青岛 266042）

红松（PinuskoraiensisSieb.et Zucc）又名果松，属于松科植物，主要分布在我国东北长白山到小兴安岭一带。很早之前日本民间就流传用松塔煮水治疗胃癌的偏方［1］。化学成分研究表明，红松松塔中含有萜类、木质素、黄酮、挥发油、维生素类、棕榈碱、矿物质、多糖、蛋白质，以及脂肪等多种成分［2］。药理研究证实松塔多糖具有抗氧化、调节免疫机能、抑制肿瘤、抗菌、抗病毒等功效，其中调节免疫机能及抑制肿瘤等功效尤为突出。在日本已将松塔多糖作为健康食品和医药品的原料，并已申请了专利［3］。

目前，植物多糖含量测定的常用方法有苯酚-硫酸法和DNS法（3，5-二硝基水杨酸比色法）等方法，其中DNS法过程简单，操作简便，且测定结果少受杂质干扰［4］，尤其适用于含有杂质组分的多糖样品；此外，不使用具有腐蚀作用的浓硫酸，亦为本法之突出优点。本实验中尝试将DNS法用于红松松塔多糖成分的含量测定，进行了以下系列研究，该工作尚未见有文献报道。

1 材料

1.1 材料

红松松塔多糖提取物（本实验室制备）；葡萄糖；苯酚；NaOH；Na2SO3；酒石酸钾钠；3，5-二硝基水杨酸；盐酸（以上试剂均为分析纯）。

1.2 仪器

FA1004N型电子天平（上海精密科学仪器有限公司）、SHZ-III式循环水真空泵（上海亚荣生化仪器厂）、80-2B型台式低速离心机（上海菲恰尔分析仪器有限公司）、RE-52型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）、T6新世纪紫外-可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）。

2 实验方法

2.1 相关溶液的制备

2.1.1 对照品溶液的制备

取105℃恒重的葡萄糖对照品50mg，精密称定，加适量水溶解，转移至100mL容量瓶中，稀释、定容，即得葡萄糖对照品溶液。

2.1.2 样品溶液的制备

取红松松塔多糖提取物样品400mg，精密称定，加适量纯水，沸水浴中加热振摇使溶解，趁热过滤，热水冲洗滤渣，将洗液、滤液混合，转移至50mL容量瓶中，稀释、定容即得样品溶液。

2.1.3 总糖溶液的制备

精密量取样品溶液2.5mL，加水2.5mL，加6mol／L盐酸溶液15mL，在沸水浴中加热40min，流水冷却至室温，加酚酞指示液1滴，摇匀，用40%氢氧化钠溶液调节至微红色，转移至25mL容量中，稀释、定容即得。

2.1.4 单糖溶液的制备

精密量取样品溶液5mL，置于10mL容量瓶中，加酚酞指示液1滴，摇匀，用1%氢氧化钠溶液调节至微红色，稀释、定容即得。

2.1.5 DNS显色液的制备

甲液：溶解2.3g苯酚于5mL 10%NaOH中并稀释到23mL，在此溶液中加入2.3g Na2SO3，溶解混匀即得；

乙液：称取85g酒石酸钾钠，将其加入100mL 10%的NaOH中，再加入293mL 1%的3，5-二硝基水杨酸溶液，混匀即得；

将甲、乙溶液相混合，即得黄色溶液，贮存于棕色试剂瓶，室温下阴暗处放置7～10天后使用。

2.2 实验条件的考察

2.2.1 最大吸收波长的确定

精密量取对照品溶液0.8mL、总糖溶液和单糖溶液各1mL，加水使成2mL，分别精密加入DNS显色液2.5mL混匀，在沸水浴中加热7min后，立即用流水冷却至室温，加水3mL摇匀，用相应的试剂做空白，照分光光度法在400～600nm范围内进行扫描，吸光度变化曲线如图1。

图1 400～600nm范围内各溶液吸收曲线图

由图1可知，对照品溶液、总糖溶液和单糖溶液的最大吸收波长（λmax）均为490mn，所以选择490nm作为含量测定波长。

2.2.2 水解条件的考察

（1）酸用量的确定。精密量取样品溶液4份，每份2.5mL，各加水2.5mL，分别加6mol／L盐酸溶液5、10、15、20mL，在沸水浴中加热30min，用流水冷却后加酚酞指示液1滴，用40%氢氧化钠溶液调节至微红色，分别转移至25mL容量中，定容。每份取2mL，分别精密加入DNS显色液2.5mL混匀，在沸水浴中加热7min后，立即用流水冷却至室温，加水3mL摇匀，用相应的试剂做空白，在490nm测吸收度A。酸用量对吸光度的影响如图2。

图2 酸用量对吸光度的影响

由图2可知，本实验中，酸用量为15mL时，吸光度为最大值，即使酸用量再增大，吸光度也不再增加。因此选择15mL为适宜酸用量。

（2）水解时间的确定。精密量取样品溶液5份，每份 2.5mL，各加水 2.5mL、6mol／L 盐酸溶液15mL，分别在沸水浴中加热10、20、30、40、50min后，流水冷却至室温，加酚酞指示液1滴，用40%氢氧化钠溶液调节至微红色，转移至25mL容量中，定容。依照（1）酸用量测定中的相同方法，自“每份取2mL”起，依法测定。水解时间对吸光度的影响如图3。

图3 水解时间对吸光度的影响

由图3可知，40min时吸光度为最大值，即水解时间为40min时，多糖水解完全。所以选择40min为适宜水解时间。

2.2.3 显色条件的考察

（1）DNS显色液用量的确定。精密量取0.8mL葡萄糖对照溶液，平行6份，加水使成2mL，分别精密加入 DNS显色液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，混匀，依法测定。DNS显色液用量对吸光度的影响如图4。

图4 DNS显色液用量对吸光度的影响

由图4可知，DNS显色液用量为2.5mL时吸光度最大，说明DNS显色液用量为2.5mL时反应完全，故DNS显色液最佳用量为2.5mL。

（2）显色时间的确定。精密量取0.8mL葡萄糖对照溶液，平行4份，加水使成2mL，分别精密加入DNS显色液2.5mL，混匀，分别沸水浴3、5、7、10min，取出，依法测定。显色时间对吸光度的影响见图5。

图5 显色时间对吸光度的影响

由图5可知显色时间7min时吸光度最大，所以选择最佳显色时间为7min。

2.3 DNS法方法学考察

2.3.1 线性关系的考察

精密量取 0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1mL的葡萄糖对照品溶液，加水使成2mL，依法测定。以葡萄糖浓度（mg／mL）为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制490nm标准曲线、得出回归方程，见图6。

图6 DNS法标准曲线

由图6可知标准曲线为y＝18.7x-0.2232（R2＝0.9993），在20～67mg／L浓度范围内线性关系良好。

2.3.2 精密度实验

精密量取总糖样品溶液、单糖样品溶液各6份，每份2mL，依法测定，相关数据记录见表1。结果表明该法精密度良好。

表1 精密度实验结果

2.3.3 重现性实验

取同一批号样品5份，依法制备、测定，相关数据见表2。由表可知该方法重现性良好。

表2 重现性实验结果

2.3.4 稳定性实验

精密量取水、单糖溶液、总糖溶液各2mL，依法测定。每隔30min测定1次，共测2h，相关数据见表3。结果表明该方法2h内稳定性良好。

表3 稳定性实验结果

2.3.5 加样回收率实验

取多糖粗品5份，每份约20mg，精密称定，精密加入葡萄糖对照品5mg，依法制备、测定。结果如表4所示，表明样品回收率理想，此方法可行。

表4 加样回收率实验结果

2.4 样品多糖含量测定

依法对三批样品进行制备、测定，结果如表5。

表5 样品含量测定

3 结论

本实验中发现，实验条件对结果的影响颇为明显，经实验考察后选择490nm作为测定波长，最佳水解条件为酸用量15mL、水解时间40min，最佳显色条件为显色剂用量2.5mL、显色时间7min。方法学考察结果显示：稳定性、重现性、精密度等均在规定范围内，平均加样回收率99.47%，RSD＝1.68%。该方法操作简便，测定结果准确，重复性好，可用于红松松塔多糖含量测定。

［1］ Sakagami H，Takeda K，MakinoY，et al.Partial purification of novel differentiation-inducing substances（s）from hot water extract of Japanese pine cone［J］.Jep.J.Cancer Res，1986，77（1）：59-61.

［2］ 王智航，张永红，于婉婷，等.红松松塔、松子壳研究进展及在畜牧业中应用可行性分析［J］.国外畜牧学——猪与禽，2009，29（4）：88-89.

［3］ 刘光明，吕永俊，周萍，等.松属植物的松塔、松子壳药用开发［J］.大理学院学报，2007，6（12）：78-80.

［4］ 李卫彬，阳文辉，黄锁义，等.当归总糖还原糖和多糖的含量测定方法探讨［J］.微量元素与健康研究，2008，25（3）：46-47.