高产琥珀酸重组大肠杆菌的构建及厌氧发酵*

赵锦芳，华渤文，王永泽，赵筱，王金华

1(湖北工业大学发酵工程教育部重点实验室，湖北武汉，430068)

2(工业发酵湖北省协同创新中心，湖北武汉，430068)

琥珀酸(又称丁二酸)，是一种重要的C4平台化合物，广泛地应用于食品、医药、农药和塑料等行业。同时，琥珀酸可以用于合成一些重要的化工产品，如1，4-丁二醇，四氢呋喃，γ-丁内酯以及聚丁二酸丁二醇酯(PBS)类生物可降解材料，其世界市场需求量极大［1］。采用微生物发酵法生产琥珀酸，由于其利用可再生资源，原料来源广泛，价格低廉，污染小，并且在发酵过程中可以固定CO2，具有很好的应用前景，近年来引起研究者的广泛关注［2］。目前，用于发酵法生产琥珀酸的菌株很多［3-6］，但大多数菌体代谢途径复杂，且由于自身生物合成的限制，对营养要求很高，从而增加了培养基、产物纯化和废弃物处理方面的成本，给工业化应用带来一定的阻碍。

大肠杆菌(Escherichia coli)由于具有遗传背景清楚、易操作、易调控、培养基要求简单和生长迅速等优点，近年来被广泛用于研究以获得高产琥珀酸的优良菌株。野生型大肠杆菌在有氧条件下主要发酵产物是乙酸，琥珀酸仅作为TCA循环的中间产物，不会积累。而在厌氧环境下，E.coli进行混合酸发酵，产生一系列有机酸(甲酸、乙酸、琥珀酸、乳酸)和乙醇等，琥珀酸仅占总代谢产物的7.8%左右［7］。因此，必须运用代谢工程手段对现有的菌种进行改造，阻断其他竞争性支路，将代谢流引向琥珀酸的生成。本研究以野生型大肠杆菌E.coli W为起始菌株，利用Red同源重组系统分别敲除其乳酸脱氢酶基因(ldhA)、乙醇脱氢酶基因(adhE)、丙酮酸甲酸裂解酶基因(pflB)、丙酮酸氧化酶基因(poxB)和乙酸激酶基因(ackA)，再通过无氧生长进化筛选的方法，获得了高产琥珀酸的大肠杆菌工程菌。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒

野生型E.coli W为本实验室保藏菌株。重组敲除系统质粒pKD46(包含编码重组系统的基因)、pKD3(包含FRT-cat-FRT阅读框)、pKD4(包含FRT-kan-FRT阅读框)、FLP重组酶的表达质粒pCP20由本实验室保存。

1.1.2 主要试剂

DNA Marker、PCR Master Mix，购自 Fermentas 公司;细菌基因组DNA抽提试剂盒，购自天根生物有限公司;氨苄青霉素、卡那霉素，Mersco公司;L-阿拉伯糖，Sigma公司;蛋白胨、酵母粉，Oxiod公司;分析纯葡萄糖、NaCl和琼脂，国药集团化学试剂有限公司;PCR引物合成，上海生工生物工程技术服务有限公司。

超净工作台，苏州苏洁净化设备有限公司;高压灭菌锅，上海博讯实业有限公司医疗设备厂;恒温摇床，上海智诚分析仪器制造有限公司;恒温振荡培养箱，上海智诚分析仪器制造有限公司;移液器，德国Eppendorf公司;mycycler PCR仪，美国Bio-Rad公司;电击转化仪器，美国Bio-Rad公司;发酵罐，Sartorius Stedim，Biotech GmbH 37070，Gottingen Germany。

1.1.3 培养基

LB液体培养基:蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 5 g/L。

LB固体培养基:LB液体培养基中加2%的琼脂。

种子用培养基:NBS培养基［8］中加2%的葡萄糖。

发酵用培养基:NBS培养基中加10%的葡萄糖。

1.1.4 引物

扩增基因的引物名称和引物序列见表1。

表1 重组基因的同源引物和鉴定引物Table 1 Primers for deletion and identification of adhE and ldhL

1.2 方法

1.2.1 工程菌株的构建

利用Red重组系统分别对5个基因进行敲除［9］。根据同源重组原理设计带有45 bp左右大小的同源臂的引物，以pKD4或pKD3为模板，PCR克隆卡那霉素(Kan)或氯霉素(Cat)抗性基因。PCR产物回收经DpnⅠ限制性内切酶消化，胶回收纯化含有同源臂抗性基因的片段。用CaCl2法将pKD46转化到大肠杆菌感受态细胞中，经过氨苄青霉素抗性平板筛选后得到阳性菌落。将培养过夜的含有pKD46质粒的大肠杆菌按1%的接种量转入50 mL LB培养基中培养，同时添加L-阿拉伯糖至0.1%(W/V)，培养至OD600为0.5～0.6。将菌液冰浴20 min，4 000 r/min离心10 min。利用10%的甘油清洗菌体3次，获得电转化感受态细胞。将100 ng的同源重组抗性基因片段加入100 μL的感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴10 min，电击 (电压2 500 V)。电击结束后，立即向电击液中加入预热的900 μL的 SOC培养基，37℃150 r/min，培养3 h后涂布于抗性平板，筛选阳性重组子，利用菌落PCR进一步验证重组子的正确性。

1.2.2 抗性基因的消除

将pCP20质粒转入成功敲除基因的菌株中，30℃培养5 h后，涂于无抗性平板上，42℃过夜培养，热诱导促进FLP重组酶表达，同时质粒也逐渐丢失。

1.2.3 无氧生长进化筛选

挑取在无抗性平板上生长良好而在抗性平板上不能生长的菌落8～10个，分别接种于装满NBS液体培养基的无氧管中，观察其生长状况。反复3～5轮培养后，挑取在无氧管中生长最好的菌株，保存用于后续发酵产酸研究。

1.2.4 发酵罐发酵培养

将上述经过无氧生长进化筛选的大肠杆菌单菌落活化数代后，接入种子培养基中，200 r/min，37℃条件下摇瓶培养。当种子菌体浓度 (OD600)达到1.0～1.5左右，按5%的接种量接入带有自动调节系统的15 L发酵罐中，装液量为10 L，37℃条件下进行恒温厌氧发酵。发酵罐条件为:初始糖含量10%，转速200 r/min，以1.2 mol/L KOH 和2.4 mol/L K2CO3的混合液作为中和剂，通过自动流加方式控制pH稳定在6.8左右。定时取样，检测OD值、葡萄糖浓度、琥珀酸产量及其他杂酸浓度。

1.2.5 发酵产物分析

OD值采用紫外分光光度计测量，波长选定600 nm;所取发酵液样品在10 000 r/min离心10 min，去除细胞残留，收集上清液，用于测定残糖及其他代谢产物的含量。残糖含量和有机酸检测采用高效液相色谱法(HPLC)检测。检测条件为:Agilent 1200 series反相高效液相色谱仪，色谱柱为Bio-Rad HPX 87H，G1314B VWD检测器;流动相:0.004 mol/L H2SO4(pH 2.5);流速:0.5 mL/min;进样量:10 μL;示差检测器检测;柱温:35℃［10］。乙醇用气相色谱仪岛津 GC-2014，检测温度为 200℃，柱箱温度为40℃，流速为2 mL/min，分离比为 15∶1，保留时间为2.5 min，内标为1%的正丙醇。

2 结果与分析

2.1 大肠杆菌工程菌株WS100的构建

利用Red同源重组系统，在E.coli W野生型菌株中分别敲除乳酸脱氢酶基因(ldhA)、乙醇脱氢酶基因(adhE)、丙酮酸-甲酸裂解酶基因(pflB)、丙酮酸氧化酶基因(poxB)和乙酸激酶基因(ackA)，构建重组大肠杆菌，所构建工程菌代谢途径如图1所示。

图1 厌氧发酵琥珀酸代谢途径Fig.1 Matabolic pathway of anaerobic succinic acid fermentation

在厌氧环境下，E.coli进行混合有机酸发酵，产生琥珀酸的同时会积累较多的副产物。琥珀酸主要经过磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)转变成草酰乙酸(OAA)、苹果酸和富马酸这一代谢支路生成。因此，E.coli中丙酮酸的代谢流对于琥珀酸的生成是不利的。通过分子生物学手段敲除丙酮酸代谢流相关酶基因，阻断竞争性代谢途径，可以将代谢流引入琥珀酸的合成途径。此外，乳酸、乙醇途径切断后，细胞中累积的NADH为琥珀酸的生成提供了充足的还原力。各基因敲除引物序列见表1(各基因敲除PCR检测图略)。然而，初始工程菌无氧生长能力很弱，经过多代无氧进化筛选，获得1株在无氧条件下生长良好的菌株，并命名为WS100新菌株。

2.2 工程菌WS100的生长特性

对构建的大肠杆菌工程菌株WS100进行发酵培养及生长特性分析。结果表明厌氧条件下五个基因的缺失，造成工程菌株生长初期能量供应的减少，与野生型大肠杆菌W相比，发酵初期生长相对缓慢。如图2所示，W菌株开始阶段生长较快，2 h左右即进入对数生长期，而工程菌WS100起始生长较慢，6 h左右才进入对数生长期。进入对数生长期后，工程菌生长速率迅速增大，在24 h时菌体密度OD600达到最大值6.48，比野生菌株W提高了近1倍。

图2 E.coli WS100与E.coli W的生长曲线比较Fig.2 Comparison of the growth curve of E.coli WS100 and E.coli W

2.3 工程菌WS100的发酵特性

为了验证重组菌株E.coli WS100在发酵罐中产琥珀酸的能力，本研究采用带有pH自动调节器的15 L发酵罐为反应器进行厌氧发酵培养。采用NBS液体培养基，装液量为10 L，初始葡萄糖浓度为10%，控制发酵罐转速为200 r/min，温度为37℃，发酵过程中用1.2 mol/L KOH和2.4 mol/L K2CO3的混合液作为中和剂。

发酵结果如图3所示，工程菌WS100在低营养成分的无机盐培养基中具有良好的发酵能力。发酵液中主要代谢产物为琥珀酸，仅有少量乙酸和乳酸生成，无甲酸、乙醇产生。E.coli WS100和E.coli W都具有较强的耗糖能力，E.coli W从2 h左右耗糖量迅速增加，而工程菌WS100则开始于6 h左右，这与两者的生长曲线基本吻合。E.coli W在72 h时，发酵罐中100 g/L的葡萄糖基本完全被消耗掉，E.coli WS100至发酵结束共消耗91.87 g/L葡萄糖。野生菌W在厌氧条件下进行混合酸发酵，主要产物包括乳酸、甲酸、琥珀酸、乙酸和乙醇，其中乳酸产量最高，为48.42 g/L，甲酸8.05 g/L，乙酸5.63 g/L，乙醇6.1 g/L，琥珀酸产量很低，仅7.57 g/L。经过基因改造后，工程菌WS100发酵产物主要是琥珀酸，从第8 h开始，琥珀酸产量持续增加，发酵72 h共积累琥珀酸70.13 g/L，琥珀酸的生产强度为0.98 g/(L·h)，琥珀酸对葡萄糖的质量收率达到76%。发酵副产物分别为乙酸5.34 g/L，乳酸0.15 g/L，没有检测到甲酸和乙醇的生成。结果表明，五基因缺失后，工程菌WS100琥珀酸产量明显提高，是野生菌株W的9.3倍。

图3 E.coli WS100与E.coli W厌氧发酵产物检测Fig.3 Anaerobic fermentation results of E.coli WS100 and E.coli W

3 结论与讨论

近年来，代谢工程策略已经广泛应用于大肠杆菌代谢途径调控研究中，以获得高产琥珀酸的优良菌株。目前大肠杆菌工程菌的构建主要集中于琥珀酸竞争性支路关键酶基因的敲除及过量表达外源酶基因(丙酮酸羧化酶 pyc、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc、苹果酸脱氢酶mdh)，以强化琥珀酸代谢支流。Chatterjee［11］等通过敲除 ldhA和 pflB获得双基因突变株NZN111，又经过自发突变磷酸转移酶ptsG基因后，获得高产琥珀酸的菌株AFP111，其琥珀酸产量可达36 g/L，副产物产量很低。Andersson等以大肠杆菌C600为出发菌株，分别敲除ldhA、pflB和ptsG三基因，获得工程株AFP184可同时利用五碳糖和六碳糖，琥珀酸产量为48 g/L［12］。佛罗里达大学Jantama等以E.coli C为起始菌株，通过多基因敲除策略，构建高产琥珀酸的优良菌株KJ134，其琥珀酸产量接近最大理论值，这是目前所报道的琥珀酸产量最高的重组大肠杆菌菌株［13］。国内于丽等以ldhA和pflB双基因缺失菌株JM001为出发菌株，敲除其ppc基因，同时利用质粒过量表达pck基因，所获得的工程菌琥珀酸产量为 28.87 g/L［14］。曹剑磊［15］等利用 Xer/dif重组酶系统对E.coli CICIM B0013进行代谢途径的调控研究，敲除 ackA-pta、ldhA、pflB、adhE，进一步对其PTS系统进行修饰并适当增强ppc表达剂量，成功获得1株具备较强琥珀酸生产能力的菌株E.coli CICIM B0013-1050(pTH-ppc)，该菌株厌氧转化葡萄糖36 h，琥珀酸产量达到36.2 g/L。

本研究通过敲除野生型大肠杆菌W琥珀酸竞争途径的基因，并进一步通过无氧生长进化筛选的方法，构建得到E.coli WS100使得琥珀酸成为厌氧发酵过程的主要产物，并且产物浓度、生产强度和质量收率均达到较高水平。E.coli WS100经过72 h发酵，琥珀酸产量可达到70.13 g/L，琥珀酸的生产强度为0.98 g/(L·h)，葡萄糖-琥珀酸转化率为76%。发酵液中副产物含量低，乙酸含量为5.34 g/L，乳酸产量仅为0.15 g/L，未检测到甲酸和乙醇生成。该工程菌可有效利用低营养成分的无机盐培养基，在不表达任何外源基因的条件下可稳定高产琥珀酸，具有深入研究的价值和一定的工业应用潜力。

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