法舒地尔对大鼠心肌缺血再灌注后血管内皮功能影响

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(青岛大学医学院附属医院黄岛院区心内科，山东 青岛 266555)

急性心肌梗死后，尽早行再灌注治疗可明显改善心肌的缺血坏死,但是再灌注同时又可加重心肌的损伤。研究结果显示，Rho激酶抑制剂法舒地尔具有拟缺血预适应及缺血后处理的保护效应[1-2]，可显著减轻心肌缺血再灌注(IR)损伤。已知动脉粥样硬化发生的始动因素是内皮细胞受损，而Rho激酶可通过蛋白激酶-C途径下调内皮细胞一氧化氮合酶的表达，降低内皮细胞的屏障功能，促进AS的发展[3]。但在急性心肌IR中，Rho激酶与血管内皮细胞功能之间的关系如何，目前鲜有报道。本实验通过构建大鼠心肌IR模型并予以法舒地尔药物干预，观察其对再灌注后血管内皮功能指标一氧化氮(NO)、血管性血友病因子(VWF)及心肌缺血面积的影响，旨在探讨Rho激酶抑制剂在急性心肌IR时对血管内皮细胞及心肌的保护作用。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 药物及试剂

法舒地尔购于天津红日药业股份有限公司，产品批号：1203281。大鼠NO、VWF的ELISA试剂盒及伊文蓝购于上海越研生物科技有限公司。TTC染液购于南京建成生物科技有限公司。

1.2 动物

取健康雄性Wistar大鼠30只，体质量为250～300 g，购于青岛市药品检验所。

1.3 实验分组及IR模型的建立

30只大鼠随机分为假手术组、缺血再灌注组(IR组)、法舒地尔组(FH组)，每组10只大鼠。假手术组,只在大鼠冠状动脉左前降支(LAD)处穿一丝线,但不予结扎。IR及FH组参考文献[4]的方法，经气管切开插管，呼吸机辅助呼吸，阻断左冠状动脉30 min后再灌注，构建IR模型。FH组于缺血前1 h腹腔注射法舒地尔10 mg/kg，假手术组及IR组于缺血前1 h腹腔注射等量的生理盐水。

1.4 血清中NO、VWF水平测定

分别于再灌注后2、24 h取血，迅速离心，留取血清标本，-20 ℃保存。严格按照试剂盒要求，检测血清中NO、VWF水平的变化。

1.5 心肌缺血面积的测定

于再灌注后24 h，经大鼠颈总动脉注入10 g/L伊文蓝2 mL，2 min后取出完整心脏，冲洗，确定缺血心肌(非缺血区蓝色，缺血区白色)。从取出的心脏中分离出左心室(包括室间隔)。从距心尖部位1 cm处，以垂直于左室长轴的方向切下约2 mm厚的薄片；照相后，37 ℃下放入1 g/L的TTC染色15 min，蓝色区域为非缺血区，红色区域为缺血区,梗死区域不着色,拍照，使用图像分析系统测量，并按照公式计算缺血面积，缺血面积=(缺血区心外膜长度+心内膜长度)/(左心室心外膜周长+心内膜周长)×100%。

1.6 统计学处理

2 结 果

2.1 各组大鼠血清中NO、VWF水平比较

与假手术组相比，IR组再灌注2、24 h后血清中NO含量显著下降，VWF活性显著升高，差异有显著性(F=10.08～118.66，q=6.32～19.80，P<0.01)。与IR组相比，FH组再灌注2、24 h后血清中NO含量明显升高，VWF活性显著下降，差异有显著性(q=3.69～17.77，P<0.05)。见表1。

2.2 再灌注24 h后心肌缺血面积比较

IR组与FH组再灌注24 h后心肌缺血面积分别为58.25±13.3、30.67±8.71，两组比较差异有显著意义(t=6.01，P<0.05)。

表1 各组大鼠再灌注2、24 h后血清中NO、VWF水平的变化

3 讨 论

随着冠状动脉再通术的发展，心肌IR损伤日益受到关注。研究表明，心肌IR时，内皮细胞的抗氧化活性大大降低。内皮细胞的功能障碍及NO合成的减少导致中性粒细胞聚集被激活,并释放大量氧自由基等毒性产物及破坏性蛋白酶,从而改变血管的通透性，影响冠状动脉微循环[5]。

研究证实，心肌缺血预适应与缺血后处理可显著减轻心肌IR损伤。单亮等[6]通过比较缺血预处理、缺血后处理对急性IR损伤心肌生化指标的影响，结果显示，缺血后处理和缺血预处理具有相似的心肌保护作用。而目前一些研究显示，法舒地尔作为Rho激酶抑制剂具有拟心肌缺血预适应及缺血后处理的心肌保护效应。

WOLFRUM等[1]应用小鼠在体心肌IR模型进行研究,在缺血前1 h腹腔注射FH(10 mg/kg)，结果显示，再灌注时白细胞聚集及黏附能力明显降低，并明显减少心肌梗死面积(减少38%)。另外，HAMID等[2]在缺血35 min和再灌注10 min分别测定Rho激酶活性,结果显示，Rho激酶活性在再灌注时明显增高。进一步的研究结果显示，Rho激酶抑制剂与缺血预适应的保护效应存在共同的信号通路,即通过PI3激酶-AKT-内皮型一氧化氮合酶(e-NOS)信号途径作用于细胞内终末靶点[7-8]；而其拟缺血后处理的保护效应则与Rho激酶活性在再灌注时明显增高密切相关[2]。本实验同样证实，相比IR组，在缺血前1 h应用法舒地尔可显著减少IR后心肌缺血面积。

VWF是内皮细胞分泌的一种多聚体糖蛋白，其通过特异的血小板膜受体(糖蛋白Ⅰb-Ⅸ复合物)介导血小板与内皮下层的黏附，其增高有利于血小板的黏附[9]。当内皮细胞受到刺激或损伤时,VWF能够从内皮细胞分泌到血浆或血管内皮下,是内皮功能损伤的一个敏感指标[10]。

NO在体内由NOS催化L-精氨酸产生，其中受钙调蛋白可逆性调节的e-NOS，可在低水平上调控NO的产生,参与体内多种生理功能的调节[11]。NOS在心肌IR中起着重要的作用,尤其e-NOS与冠状动脉舒缩状态相关。已知NO、e-NOS激活介导缺血预适应的延迟保护效应,是缺血预适应的保护机制之一[12]。近年来研究显示，Rho激酶抑制剂可通过PI3激酶-AKT-e-NOS信号途径作用于细胞内终末靶点，对IR损伤起保护作用。其具体机制为：蛋白激酶PI3、AKT可通过磷酸化e-NOS而调节其活性，使e-NOS进一步促进内源性NO产生；NO通过拮抗内皮素、促进血管扩张、保护内皮功能、抑制血小板聚集、抑制心肌和血管内超氧化物形成等发挥保护作用[13]。

本实验同样表明，在急性心肌IR时血清中NO含量降低、VWF活性升高,可能原因为IR后氧自由基产生增加,内皮细胞抗氧化活性下降，发生脂质过氧化损伤,导致内皮细胞功能障碍所致。而本实验结果进一步显示，应用法舒地尔干预治疗后，再灌注时血清中NO含量较IR组有所增加，VWF活性有所下降，表明法舒地尔可能通过抑制Rho激酶活性及激活细胞内PI3激酶-AKT-e-NOS信号通路，促进再灌注期NO的合成，减少内皮细胞损伤，从而降低VWF的分泌。

以往研究表明，Rho/Rho激酶可通过多种信号途径参与调节细胞的生长、凋亡和细胞周期。而法舒地尔作为Rho激酶抑制剂，可抑制缺血状态下心肌细胞的凋亡，降低梗死面积。本实验从另外一方面证实，Rho激酶抑制剂可显著保护血管内皮细胞功能，为临床上冠状动脉再通后的药物治疗提供更多可能证据。

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