咽炎饮对咽炎大鼠血液流变学和炎症因子的影响

段美秀，王志义 （.辽宁医学院研究生学院，辽宁 锦州00；.锦州石化医院，辽宁 锦州00）

咽炎是常见的上呼吸道疾病，由于气候变化、生活条件和工作环境等的影响，发病率正逐年上升，尤其在季节变换的时候，又以吸烟者居多。有单一采用中药汤剂或中成药的动物实验研究，也有联合抗菌药或地塞米松的治疗研究。而抗菌药的长期或反复应用，容易引起咽部菌群失调，造成咽炎易发，不利于根治。同时，针对上感等易引发咽炎的疾病和咽炎易感人群，用于预防的药物研究甚少。中医认为“咽喉为肺之关，胃之门”，因而研究咽炎的发生发展、有效防治咽炎在临床上显得尤为重要。咽炎饮是锦州石化医院院内处方，由金银花20 g、连翘20 g、板蓝根30 g、薄荷10 g、麦冬15 g等组成，开水泡服，简便易行，加入薄荷、金银花等改善口感，气味芳香，诸药合用清热利咽、滋阴、消肿，清中有补，适于广大咽炎患者的治疗和预防。本实验对大鼠急性咽炎模型予以咽炎饮灌胃，考察咽炎饮的效用和作用机制，以丰富临床治疗。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 双黄连口服液（哈药集团三精制药，批号100902）；大 鼠 TNF－α（批 号20110429）、IL－1β（批 号20110424）试剂盒，购自上海酶联生物科技有限公司；兔抗大鼠MMP－2（批号BA1173）、MMP－9（批号BA1178）抗体均购自北京博奥森公司。

1.2 咽炎饮药物配备 咽炎饮组方为金银花、连翘、板蓝根、大青叶、麦冬、蒲公英、薄荷等（锦州石化医院中药房提供，经辽宁中医药大学严锋教授鉴定为正品）。将1剂咽炎饮中的板蓝根、连翘、麦冬研末，与金银花、薄荷等一起置于500 mL的广口瓶中，加入沸水350 mL，密封浸泡20 min（每5 min摇匀1次）后，封闭过滤取滤液，向滤渣中再加沸水350 mL，浸泡摇匀20 min同前，过滤后合并滤液，用旋转蒸发仪浓缩成136 mL（相当于生药1.8 g·mL－1）药液，4 ℃存放，备用。

1.3 实验动物、模型制备及分组 清洁级SD 雄性大鼠50只，体质量200～250 g，辽宁医学院实验动物中心提供，合格证号：SCXK（辽）2003－0007。

从实验动物中心领取大鼠，适应性喂养1周后，随机分为5 组：空白组、模型组、双黄连组、治疗给药组和预防给药组，每组10 只。除空白组外，其余4组给予15%浓氨水喷咽，bid，每次3掀，连续3 d［1］。预防组每次造模前10 min给予咽炎饮2 mL灌胃，bid，余组正常喂养。造模成功后，给予双黄连2 mL（双黄连组）、咽炎饮2 mL（治疗组）灌胃，预防组继续灌胃如前，连续1周，每日记录大鼠一般状态。

1.4 血液流变学检测 上述处理后，全部大鼠禁食水12 h，次日晨起称重，腹腔20% 乌拉坦（5 mL·kg－1·d－1））麻醉。开胸，于心尖处取血4 mL后进行检测。

1.5 ELISA 检测TNF－α、IL－1β含量 100 mg组织制成匀浆，提取上清液→稀释标准品→标准品孔加入标准品50μL和链霉亲和素－HRP50μL，样品孔加入组织上清液40μL、链霉亲和素－HRP50μL 和生物素标记二抗10μl，混匀，37℃反应60 min→30倍浓缩洗涤液用30倍纯化水稀释，重复洗板5 次，拍干→每孔先后加入50μL显色液A、B，混匀，37℃避光显色10 min→每孔加入50μL 终止液→10 min之内，以空白孔调零，于450 nm 波长处测各组吸光度（OD 值）并记录。

1.6 Western－Blot测定MMP－2 和MMP－9 表达 100 mg组织加入裂解液剪碎，移入EP管中，超声粉碎，4 ℃、12 000 r·min－1离心25 min，取上清液测蛋白含量。各取等量的样本进行SDS－PAGE电泳，浓缩胶电压80 V，分离胶电压120 V，半干法将蛋白质转移到PVDF 膜上，TBS 冲洗，封闭，TBS冲洗，将膜放入一抗（1∶500稀释）中，4 ℃过夜。TTBS冲洗后，将膜放入二抗（1∶500稀释）中，室温孵育1～2 h，然后TTBS洗膜3次，每次10 min，NBT／BCIP 显色液中避光显色，直至出现，终止反应。扫描蛋白印迹显影图，利用凝胶自动分析成像软件Chem Image 5500 对蛋白带进行分析。以各组MMP－2、MMP－9表达与内参表达比值表示MMP－2、MMP－9的相对表达水平。

2 结果

2.1 一般状态 模型组大鼠食量减少，饮水增多，呼吸加快，声音嘶哑，严重者可闻及痰鸣音。肉眼可见咽部红肿，有黄白溃疡点，附着透明黏稠分泌物。

2.2 血液流变学检测结果 模型组各指标较空白组均有升高（P＜0.05），差异有统计学意义。其他组与模型组相比（P＜0.05），说明咽炎饮和双黄连都是有效的。而与双黄连组比较，治疗组和预防组多数指标略有下降，只有全血还原黏度比较有统计学意义（P＜0.05），说明咽炎饮改善咽炎大鼠微循环的效果显著，比双黄连疗效略好。见表1、表2。

表1 咽炎饮对大鼠咽炎血液流变学的影响±s，n＝10）Tab 1 Effects of pharyngitis drink on blood rheology in pharyngitis rats±s，n＝10）

表1 咽炎饮对大鼠咽炎血液流变学的影响±s，n＝10）Tab 1 Effects of pharyngitis drink on blood rheology in pharyngitis rats±s，n＝10）

注：与空白组比较，aP＜0.05；与模型组比较，b P＜0.05；与双黄连组比 较，c P＜0.05

组别 全血黏度／m Pa·s 全血还原黏度／m Pa·s高切（150 s－1）低切（1 s－1）高切（150 s－1） 低切（1 s－1）空白组 4.8±0.5bc 11.6±0.4b 7.6±0.4bc 25.90±0.32 bc模 型 组 7.6±0.9ac 12.7±0.7ac 8.6±0.5a 6.7±0.5ac双黄连组6.0±0.8ab 11.7±0.4b 8.3±0.4a 26.6±0.4ab治疗组 5.9±0.7ab 11.7±0.4b 8.09±0.32bc 26.5±0.4ab预防组 6.0±1.9ab 11.7±0.4b 8.1±0.4bc 26.48±0.34 bc

表2 咽炎饮对大鼠咽炎血液流变学各指标的影响±s，n＝10）Tab 2 Effects of pharyngitis drink on the parameters of blood rheology in pharyngitis rats±s，n＝10）

表2 咽炎饮对大鼠咽炎血液流变学各指标的影响±s，n＝10）Tab 2 Effects of pharyngitis drink on the parameters of blood rheology in pharyngitis rats±s，n＝10）

注：与空白组比较，aP＜0.05；与模型组比较，b P＜0.05；与双黄连组比 较，c P＜0.05

组别 血浆黏度／mPa·s红细胞压积／%红细胞聚集指数红细胞刚性指数空白组 1.39±0.26b 44.3±0.7bc 2.77±0.32b 6.6±0.8 bc模型组 1.86±0.33ac 48.0±0.6a 3.1±0.4ac 7.6±1.1a双黄连组1.5±0.4b 47.6±0.7a 2.64±0.25b 7.1±0.6a治疗组 1.6±0.4b 47.1±0.6ab 2.6±0.4b 6.8±0.8b预防组 1.6±0.25ab 47.4±0.8ab 2.6±0.4b 7.3±0.8 ab

2.3 ELISA 检测TNF－α、IL－1β结果 与空白组比较，模型组TNF－α、IL－1β显著增多（P＜0.05），差异有统计学意义；经咽炎饮预防和治疗给药后TNF－α、IL－1β减少（P＜0.05），说明咽炎饮抑制炎症因子释放，对抗大鼠咽炎的效果显著；与双黄连组比较（P＜0.05），疗效较双黄连更好。见表3。

2.4 Western－Blot测定MMP－2、MMP－9表达的结果 模型组MMP－2、MMP－9表达较空白组增强（P＜0.05），差异有统计学意义；经咽炎饮预防和治疗给药后均有MMP－2、MMP－9表达减弱（P＜0.05）；与双黄连组疗效比较差异有统计学意义（P＜0.05），说明咽炎饮抑制蛋白表达比双黄连效果更好，对抗大鼠咽炎有统计学意义。见图1和表4。

表3 咽炎饮对咽炎大鼠TNF－α和IL－1β的影响±s，n＝10）Tab 3 Effects of pharyngitis drink on TNF－αand IL－1βin pharyngitis rats±s，n＝10）

表3 咽炎饮对咽炎大鼠TNF－α和IL－1β的影响±s，n＝10）Tab 3 Effects of pharyngitis drink on TNF－αand IL－1βin pharyngitis rats±s，n＝10）

注：与空白组比较，aP＜0.05；与模型组比较，b P＜0.05；与双黄连组比 较，c P＜0.05

组别 TNF－α／ng·L－1 IL－1β／ng·L－1空白组 40.6±7.6bc 56.5±11.2 bc模型组 88.3±9.4ac 94.3±10.5ac双黄连组 50.9±9.8ab 67.9±9.8ab治疗组 48.5±7.6b 60.3±7.6b预防组 75.6±8.2bc 78.9±8.7 bc

图1 各组大鼠MMP－2和MMP－9的表达1－空白组；2－模型组；3－双黄连组；4－治疗组；5－预防组Feg 1 The expression of MMP－2 and MMP－9 of Rats in each group 1－blank group；2－model group；3－shuanghuanglian－group；4－treatment group；5－prevention group

表4 咽炎饮对咽炎大鼠MMP－2和MMP－9表达的影响±s，n＝10）Tab 4 Effects of pharyngitis drink on the expression of MMP－2 and MMP－9 in pharyngitis rats±s，n＝10）

表4 咽炎饮对咽炎大鼠MMP－2和MMP－9表达的影响±s，n＝10）Tab 4 Effects of pharyngitis drink on the expression of MMP－2 and MMP－9 in pharyngitis rats±s，n＝10）

注：与空白组比较，aP＜0.05；与模型组比较，b P＜0.05；与双黄连组比 较，c P＜0.05

组别 AMMP－2／Aβ－actin AMMP－9／Aβ－actin空白组 0.42±0.25bc 0.35±0.08 bc模型组 1.02±0.14ac 0.96±0.35ac双黄连组 0.77±0.05ab 0.78±0.12ab治疗组 0.65±0.10abc 0.55±0.06bc预防组 0.54±0.04bc 0.57±0.03 bc

3 讨论

咽下接食道，与胃相通，司饮食吞咽；下接气道，与肺相通，共同行呼吸和发音。模型组大鼠咽部红肿，有溃疡，附着透明黏稠分泌物，属热毒蕴结证［2］，故食量减少，呼吸加快，声音改变。咽炎蔓延，红细胞因表面电荷失衡而聚集，且咽部长时间异物刺激产生代谢性毒物使红细胞功能受损、变形性降低，使血液呈“高黏状态”［3］。血液黏度愈高，流变性愈小，流速愈慢，流量愈少［4］。如表1、2 所示，与模型组比较，经过咽炎饮灌胃，血液的黏、凝、聚改变明显减轻（P＜0.05），表明咽炎饮能有效改善咽炎。

炎症反应早期，单核一巨噬细胞即释放TNF－α，随炎症蔓延，TNF－α 亦增多，在炎症反应过程中起着重要作用。TNF－α既可作用于其他免疫细胞和免疫辅助细胞，也可诱生其自身及IL－1 等细胞因子，促进炎症反应清除病原［5］。咽炎发病时，作为炎症反应主要介质的的IL－1β增多，通过刺激造血细胞和淋巴细胞增殖分化，抑制金属蛋白酶组织抑制因子，调节宿主对微生物感染的免疫反应及参与细胞外基质的分解代谢，在咽炎发生发展过程中起重要作用。同时，IL－1β诱导单核—巨噬细胞产生更多的TNF－α和IL，促进黏附因子和趋化性细胞因子的产生，进而引起单核细胞和T 淋巴细胞的聚集与浸润［6］。如表3 所示：与空白组比较，模型组TNF－α、IL－1β分泌明显增多，而经咽炎饮灌胃者TNF－α、IL－1β分泌显著减少（P＜0.05），且较双黄连更能减少TNF－α、IL－1β分泌，抑制炎症蔓延。

正常组织只有少量的MMP，炎性细胞侵入后便成为MMP的生产来源。同时，TNF－α、IL－1β的释放可诱导MMP合成［7］。炎性细胞浸润，与炎性因子相互诱导影响MMP的表达。MMP－2、MMP－9是水解变性胶原及基膜的主要成分，可影响酶与细胞外基质的相互作用。有文献报道，抑制MMP－2可有效减轻组织破坏及炎症过程［8］。综上所述，咽炎饮对大鼠咽炎既有治疗作用，又有预防作用，且疗效较双黄连为好。其作用机制可能与改善微循环和抑制炎症因子分泌有关，具体机制有待进一步研究。

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