核磁共振氢谱研究二氢杨梅素的抗氧化机理

郑秋闿，范晶晶，陈鸣才，许 凯

（1.潍坊学院化学化工与环境工程学院，山东潍坊 261061；2.潍坊学院生物与农业工程学院，山东潍坊 261061；3.中国科学院广州化学研究所，广东广州 510650）

二氢杨梅素（DMY）属于黄酮类化合物，大量存在于葡萄科蛇葡萄属植物中，具有消炎抑菌［1］、抗高血压［2－3］、保护肝脏［4－6］等作用，可以作为天然抗氧剂应用于油脂及高油食品的保藏［7－8］。在本实验室的前期工作中，首次将DMY 应用于高分子材料中，发现DMY对各种高分子材料的抗氧化作用均优于合成抗氧剂［9－10］。本文对DMY 的抗氧化机理进行初步研究，确定了DMY 分子中发挥抗氧化作用的主要基团。本文将引发剂（过硫酸铵）作为自由基的供体，与DMY混合，研究DMY 分子上羟基的变化。本研究不仅为DMY 在高分子材料中的应用提供基本数据，而且有助于进一步揭示DMY 在生物体内的抗氧化作用机理，为其在医疗、食品等方面的应用提供理论指导。

1 实验

1.1 原材料及实验仪器

材料：DMY 粗提物，广州大学化学与化工学院；三油酸甘油酯，分析纯，天津津沽工商实业公司；其他各种化学试剂均为瓶装分析纯试剂，市售品。

仪器：超导核磁共振谱仪，DRX－400 型，德国BRUKER 公司。

1.2 DMY样品的制备及其纯度检测

DMY 粗提物加入3 倍质量的丙酮，加热回流提取30min；将回流液过滤，加入3倍体积的沸水，静置2h，置于4 ℃的冰箱中24h，使其析出针状结晶；重复沸水溶解以及结晶的过程5次，纯化得白色针状结晶。

制得的DMY 经高效液相色谱检测其纯度。色谱条件：色谱柱为Prep Nova－Pak HR C18色谱柱（3.9 mm×300mm）；流动相由乙腈、水、乙酸按1∶9∶0.1的比例制成，速率为1.0mL／min；检测波长288nm；进样量为20 μL。用面积归一法算得其纯度为99.77%。

1.3 测试方法

物质的量之比为1∶2的过硫酸铵和DMY 溶于氘代二甲亚砜，80 ℃油浴加热，分别对空白的DMY样品，加热前、加热1h、加热2h的过硫酸铵和DMY的混合样品进行核磁共振氢谱分析。

2 结果与讨论

DMY分子包含15个碳原子，6个羟基，构成C6－C3－C6的三环结构（见图1）。为了确定DMY 在抗氧化过程中起作用的基团，将引发剂（过硫酸铵）作为自由基的供体与DMY 混合，研究DMY 上羟基的变化。过硫酸铵的自由基产生的半衰期随温度的升高而缩短，100℃下为0.17h，80℃下为2.1h，60℃下为38.5h。

图1 DMY化学结构

物质的量之比为1∶2的过硫酸铵和DMY 溶于氘代二甲亚砜，加热前后的空白DMY 样品、过硫酸铵和DMY 的混合样品进行核磁共振氢谱分析，所得图谱见图2。图2中的δ 为化学位移，空白样品编号为（a），过硫酸铵与DMY 混合但未加热样品编号为（b），混合后加热1h样品编号为（c），混合后加热2h样品编号为（d）。

图2 核磁共振氢谱

DMY 的核磁共振氢谱羟基峰化学位移δ：δ＝8.23ppm 为4′—OH；δ＝8.93ppm 为3′—OH 和5′—OH；δ＝10.83ppm 为7—OH；δ＝11.88ppm 为5—OH。δ＝4.39ppm 双峰为C 环上2—H，属于比较稳定的结构，在整个清除自由基的过程中不参与反应。将各羟基峰面积Ax与δ＝4.39ppm 的峰面积A4.39相比，就能得到各羟基的相对含量（见图3）。

图3 核磁共振氢谱相对峰面积

由图3可以看到，加热前添加过硫酸铵的DMY 的羟基没有任何变化，但加热1h以后，5—OH 和7—OH的含量稍有降低，3′—OH 和5′—OH 的含量降低了一半，4′—OH 已经全部反应；加热2h以后，5－OH 和7—OH 的含量又稍有降低，3′—OH 和5′—OH 已经全部反应。可以推断，DMY 分子中各个位置羟基的反应活性如下：4′—OH 反应活性大于3′—OH 和5′—OH 的反应活性大于5—OH 和7—OH 的反应活性。

这种在具有抗氧化活性的物质中添加自由基生成剂，通过检测老化过程中抗氧化物质结构的变化，判断活性点位和抗氧化机理的方法适用于多种物质，具有通用性。

存在于植物中大多数的黄酮类化合物都具有抗氧化性，这与黄酮类物质特殊的化学结构有关，即构效关系［11］。许多实验都表明黄酮类抗氧化剂的活性与酚羟基的数目无关，但与分子中是否存在邻二酚羟基有关［12－13］，黄酮抗氧化剂的B环上取代基的特性对其抗氧化性有很大的影响。B环的酚羟基是活性中心，而A 环酚羟基清除自由基作用很弱［14］，原因是B环羟基处于邻位，可通过形成分子内氢键和共振作用两种机制使苯氧自由基趋于稳定［15－16］（见图4），而A 环羟基处于间位，不具备上述稳定机制，所以活性较差。DMY 分子中具有邻苯三酚型酚羟基结构，被抽氢后可形成2个分子内氢键，更稳定，所以其活性比邻二酚羟基更高。但如果酚羟基在形成苯氧自由基之前即与邻近的杂原子形成分子内氢键，则其抽氢反应还要克服氢键键能，这将使其活性降低［9］。大多数黄酮化合物中A 环羟基与C环的氧原子处于间位，因此A 环羟基活性总是很低，这是B环羟基成为黄酮抗氧化活性中心的又一原因。DMY分子中B环3′，4′，5′—OH 为3个相邻的羟基，在清除自由基的过程中，在电子离域作用下可形成更加稳定的自由基，同时可以作为鳌合金属离子的接合点［17］，相较B环上只有1个羟基的黄酮，抗氧化活性更强。另外，C环中3—OH，A 环中5—，7—OH 的存在同样增强了DMY清除自由基的能力。

图4 黄酮中B环稳定机理

3 结论

将DMY 与引发剂混合加热，DMY 分子上羟基的变化表明B环的3个相邻的羟基是活性中心，其特殊结构对其抗氧化性有很大的影响。

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