高效处理稀土废水并固定CO2 的新型组合式光生物反应器研究性实验

2013-12-23吕乐，杜静，闫海

实验技术与管理 2013年4期

吕乐，杜静，闫海

（1.北京科技大学化学与生物工程学院，北京 100083；2.北京石油学院附属中学，北京 100083）

微生物学是研究微生物及其生命活动规律的科学，它既是生命科学中的独立学科，又是分子生物学、遗传学和基因工程学等现代生物技术的重要基础［1－2］。微生物学实验是微生物学课程中的重要组成部分，是学生理解和掌握微生物学基本原理的必需的教学环节，在“知识、技能、创新、素质”的培养方面具有理论教学不可取代的作用。掌握微生物实验技术对培养学生的基础实验技能，锻炼学生观察能力、操作能力、思维能力与运用知识的能力以及提高学生动手能力和创新意识有着重要作用［3－4］。因此，我们在教学过程中注重理论和实践的结合，不断在教学内容上进行改革，以培养顺应时代发展的实用型和创新型人才。

近年来，针对传统微生物实验教学体系存在的诸多不足，许多高校都在对微生物学实验教学模式进行着积极的探索，尝试着在实验内容、教学模式和教学方法等方面进行着改革，取得了较好的教学效果。我们认为突出生物技术专业特色，充分利用实验教学的特点，提高学生解决实际问题的能力，加强学生实践能力和创新意识的培养是微生物实验教学必须遵循的宗旨。结合本专业特点和当前社会的热点问题——节能减排与可持续发展，我们有针对性地开展了微生物学创新性实验［5－9］项目的探索——构建高效处理稀土废水并固定CO2的新型组合式光生物反应器的研究。

1 实验目的、基本原理和材料

（1）实验目的:观察并掌握小球藻菌落特征、个体形态、生长及繁殖方式，学习并掌握血球计数板直接计数法计数小球藻细胞数目；掌握培养基的配制原理、配制程序、配制方法及高压蒸汽灭菌的原理和操作方法；了解环境因素对小球藻生长的影响，掌握小球藻优化培养的方法；根据实验要求，查阅国内外文献，设计并构建能高效处理稀土废水和固定CO2的新型组合式光生物反应器，学习并掌握TOC－TN 测定仪的原理和使用方法。

（2）基本原理:参考钱存柔、黄仪秀主编，北京大学出版社出版的《微生物学实验教程》［10］。

（3）实验仪器和材料:小球藻，组合式光生物反应器，微生物实验室各种常用药品和仪器。

2 实验内容

学生根据文献配制培养基，分离、纯化获得小球藻单克隆菌落，观察小球藻个体形态及其菌落特征；在小球藻批量培养实验中探索稀土废水浓度对小球藻生长的影响，建立吸光度与藻细胞个数（干重）之间的线性关系；设计并构建新型光生物反应器，并探索小球藻处理稀土废水和固定CO2的能力。

3 实验过程与结果

3.1 小球藻培养基的制备

实验所用小球藻来源于北京科技大学生物科学与工程系，该藻种具有自养生长和异养生长的能力。学生查阅文献，与任课教师讨论修改后确定小球藻光照自养培养基、异养培养基和培养条件。

3.2 小球藻形态结构观察及计数

学生配制小球藻光照自养培养基，采用平板涂布法从小球藻菌液中分离纯化得到小球藻单克隆菌落，观察个体形态和菌落特征，并使用血球计数板对小球藻进行计数。小球藻个体形态观察结果见图1。

图1 小球藻的细胞形态

3.3 变废为宝，以稀土废水培养小球藻

稀土废水是稀土冶炼过程中排放的废水，其中氯化铵的质量浓度一般高达11 000 mg／L 以上；高氨氮浓度的废水是引起水体富营养化的重要因素之一。目前，国内外处理氨氮废水的方法主要分为物化法和生物法［11］。由于稀土废水含氮量高而碳含量不足，因此废水的可生化性差，氨氮去除率低。微细藻类是最古老的光合作用有机体，不仅可以固定大气中的二氧化碳，而且可以吸收水体中的氮源支持其生长，同时培养出来的高脂含量的藻细胞可以用来生产生物柴油，高蛋白的藻细胞还可以作为优质饲料或肥料，因此是解决含氮废水处理与资源化的一条有效途径。

根据微生物学实验课的学时和进度安排，将学生分为4组，分别探索稀土废水质量分数为0.1%、1%、5%、10%对小球藻异养生长的影响。具体的实验方案:将高浓度的稀土废水按比例稀释，向其中添加其他营养成分（葡萄糖、磷酸盐等），经121℃的高温灭菌后作为培养基。每组均按照接种后光密度OD680nm为1.0的接种量接种，在200r／min、25 ℃下黑暗异养培养，并通过测定生物量（680nm 处光密度值）（见图2和图3），图3中DWC 表示干燥后质量浓度。凯氏定氮法和TOC－TN 测定仪测定培养液中氨氮（即废水中氨氮）的利用情况（见图4），研究其对不同浓度稀土废水处理能力。

图2 光密度与小球藻细胞浓度（干燥后质量浓度）的线性关系

图3 稀土废水浓度对小球藻生长的影响

3.4 设计制作新型组合式光生物反应器

图4 小球藻对不同质量稀土废水处理效果

目前，国内外微藻光反应器主要有开放式和密闭式光生物反应器两大类。开放式光生物反应器即开放池培养系统，其优点是构建简单、成本低廉及操作简便，易于放大，最早应用于商业化微藻大规模培养中。然而该法培养过程受光照、温度等自然环境影响较大，并且易被杂菌和其他藻种污染，同时水分蒸发严重，CO2固定效率低，最终导致培养的藻细胞密度低、采收成本较高。密闭式光生物反应器是用透明材料组建的一类密闭式生物反应器［12］，其比表面积大，光能利用率高，在最佳状态下可达到18%，而植物和森林仅能利用入射光能的0.2%。针对开放式反应池光能和CO2利用率低、培养环境不稳定等问题，结合管道式光生物反应器光照充分，CO2利用效率高，可以获得更高的藻生物量的优势，设计制做出了一种新型组合式光生物反应器。该反应器同时具备了当前培养池和管道式光生物反应器的优点，不仅能够高效利用光能和固定二氧化碳，而且可以明显提高微藻的生长速度，在高效减排CO2和培养大量高细胞浓度微藻方面具有重要的应用价值。

3.4.1 设计思路

本设计旨在提高光能和CO2的利用效率及微藻的高效生长，因此高效的光生物反应装置需要满足以下条件:（1）充足可控的光照强度；（2）适宜微藻生长的温度；（3）pH 控制系统；（4）高效的供气和布气装置；（5）充分而均匀的混合条件。

3.4.2 设计方案

依据设计思路，新型组合式光生物反应器包括隔板反应池和螺旋管道两部分。在隔板式反应池中实现培养物充分混合、O2的释放以及适宜温度、pH 等微藻培养条件的控制；在培养管道中进一步提高微藻光合作用效率和CO2的固定能力，从而达到高效固定CO2和高效培养微藻的目的。

3.4.3 工作原理

本装置主要由隔板反应池和螺旋培养管道两部分组成，总容积28L，培养体积21L（见图5）。隔板反应池主要由微孔曝气管、温控装置和潜水泵组成。微藻培养物在反应池中经微孔曝气、pH 值和温度调节、在隔板反应池中实现混合流动、O2释放及培养条件的控制，实现微藻的快速生长；潜水泵将混合后的微藻培养物从培养池中泵入螺旋管道，同时通入CO2使其与微藻在管道中充分进行光合作用，从而完成CO2的高效固定。从螺旋管道流出的培养物再次进入隔板反应池实现循环。由此构成隔板反应池和螺旋管道组合的节能固碳微藻培养系统，在高效固定CO2和高效培养微藻方面具有重要的应用前景。

图5 新型组合式光生物反应器

3.5 节能减排，新型光生物反应器处理稀土废水固定CO2的效果

学生运用自制的新型光生物反应器，研究小球藻在光生物反应器中处理稀土废水并固定CO2的效果，并对其进行优化。将异养培养获得的高细胞浓度小球藻液，按照接种后OD680nm为1.0的接种量接种到自制的新型组合式光生物反应器中。培养体积为20L，培养温度28 ℃，培养周期为6d。培养过程中通过pH计监测培养体系pH 变化，通过蠕加泵流加酸碱控制pH 在6.5左右。CO2浓度采用SCY－2A 二氧化碳气体测定仪进行测定，CO2固定效率通过测定进气和出气中的CO2浓度进行计算。每24h进行CO2的测定，并取样进行藻细胞浓度的测定。实验结束后测定各个样品并进行分析。结果表明:稀土废水含量为1%、小球藻接种后OD680nm为1.0、运行新型组合式光生物反应器6d，小球藻生长状况最好，此时稀土废水中氨氮去除率和CO2的固定率均可达80%，实现了节能减排、高效去除氨氮并固定CO2的目标。

4 效果

本创新实验采用既能光照自养生长又能异养生长的小球藻USTB－01，学生在批量培养实验中探索稀土废水不同质量分数对小球藻异养生长的影响，在此实验中使学生初步掌握微生物优化培养的方法，熟练使用显微镜、分光光度计、凯氏定氮仪和TOC－TN 仪等仪器，能够分析实验结果并建立各数据之间的线性关系。学生通过查阅文献，集思广益，共同设计并成功构建了组合式新型光生物反应器，研制的新型组合式微藻光生物反应器能够有效地利用光源，与其他光生物反应器相比具有更大的优势，能够更高效固定CO2，培养获得高浓度小球藻。通过小球藻培养处理废水和废气，在降低处理成本的同时获得较高的经济效益和环境效益，达到了“变废为宝”、“节能减排”的目的，因此利用小球藻处理污水，同时利用太阳光能进行光合作用固定CO2具有很高的应用前景。

学生自主设计、教师指导的微生物学设计性实验——高效处理稀土废水并固定CO2的组合式光生物反应器研究内容贴近生产、生活实际和研究热点，具有一定的基础性和探究性［12］。实验由教师指定实验范围，学生查阅资料，自主设计实验方案、准备实验材料、自己动手完成实验、观察分析实验结果，并解决实验中出现的问题，最后撰写出规范的实验报告。学生在实验过程中不仅对微生物学的基本实验操作进行了反复训练和强化，规范了实验操作，而且通过亲自查阅文献，分析讨论实验中遇到的各种问题，设计并制作组合式光生物反应器，激发了学生探索研究的兴趣，培养了学生独立的思维能力、严谨的科学态度、百折不挠的工作作风、相互协作的团队精神和勇于开拓的创新意识。实验中教师充当引导者、指导者、监督者和服务者的角色，在引导学生制定切实可行的实验方案、听取学生汇报实验进程中，启发学生解决实验问题等，为学生服务［13－15］。

5 结束语

虽然开设微生物学设计性实验对于培养学生创新能力和实践能力的优势明显，但在实验过程中也存在一些问题［16－17］，如实验时间如何安排更合理、实验如何安排能达到最好的实验效果等。我们的微生物学实验教学改革才起步，如何使微生物学实验教学更加适应高等教育人才培养的要求，培养出更多更好的创新型人才，我们将不断地探索和实践。

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