高效液相色谱测定蜂蜜中的脱落酸、黄酮和酚酸

孙崇臻，王 超，蔡子哲，陈沿廷，吴希阳*

(暨南大学理工学院食品科学与工程系，广东 广州 510632)

蜂蜜是指蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，与自身分泌物混合后，经充分酿造而成的天然甜物质[1]。根据蜜源植物种类的不同，蜂蜜可以分为单花蜜及混合蜜(又称杂花蜜)[1]。蜂蜜中除了含有葡萄糖、果糖等糖类物质外，还含有丰富的氨基酸、蛋白质等营养成分及黄酮酚酸等生物活性物质[2]。

不同种类的蜂蜜其化学成分不同，利用对蜂蜜化学成分的分析来判断蜂蜜植物来源及地理来源已成为一种研究方向[3]。目前国外相关研究较多，尤其是对微量活性物质黄酮酚酸及植物激素脱落酸的研究。Federico等[3]对葡萄牙产的22种单花蜜进行脱落酸的研究，确定脱落酸为石楠花蜜的主要成分，并将其用于单花蜜的蜜源判断。Lihu等[4]研究了9种桉树蜜的脱落酸及酚酸，得出红树蜜中脱落酸含量最高，将脱落酸作为桉树蜜地理来源的判别物，同时没食子酸、鞣花酸、肉桂酸作为澳大利亚桉树蜜的标志物。Lsabel等[5-6]利用高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)技术分析了突尼斯蜂蜜中的酚类物质，确定了坎菲醇与8-氧基-坎菲醇为迷迭香蜜的标志化合物，同时从澳大利亚产的小桉树蜜中鉴定出毛地黄黄酮与五羟黄酮，并证明它们可以作为不同种类桉树蜜的标志物。Francisco等[7]用HPLC法对52种单花蜜进行多酚的测定，在石楠蜜中发现了脱落酸、鞣花酸；在栗树蜜、向日葵蜜、薰衣草蜜中发现了香豆酸、肉桂酸、阿魏酸等酚酸物质。

李菁等[8]对陕西省不同地区的8种刺槐蜜的酚酸类物质进行了研究。郭夏丽等[9]采用HPLC技术，分析了洋槐蜜、枣花蜜等7种蜂蜜中的23种多酚物质，并对其抗氧化性进行研究。

本研究利用HPLC-二极管矩阵检测器(photo diode array，PDA)色谱技术对枇杷蜜、枣花蜜等8种蜂蜜中的脱落酸和14种多酚进行了测定，为单花蜜的蜜种识别及其质量监测提供依据，其中龙眼蜜、荔枝蜜、枇杷蜜为南方特有蜜种，目前国内对这3种蜜的研究较少，对其进行研究在一定程度上扩大了检测蜜种的范围。同时，多酚物质的检测为蜂蜜的活性成分分析提供依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

采集了2011年4～8月生产的8种蜂蜜，荔枝蜜(广东广州)、龙眼蜜(广东广州)、枇杷蜜(广东广州)、椴树蜜(福建福州)、枣花蜜(江西永丰)、益母草蜜(广西柳州)、野桂花蜜(广西柳州)、紫云英蜜(上海奉贤)。所有样品均置于4℃冰箱保存。

1.2 试剂

槲皮素、芦丁、3,4-二甲氧基肉桂酸、原儿茶酸、Amberlite XAD-2吸附树脂 美国Sigma公司；咖啡酸、α-儿茶酸、p-香豆酸、阿魏酸、柚皮素、木犀草素、山奈酚、芹菜素 成都生物技术有限公司；脱落酸、杨梅素 上海佳和生物科技有限公司。甲醇(色谱纯) 霍尼韦尔中国有限公司；乙醚、甲酸为分析纯；水为超纯水、蒸馏水两种。

1.3 仪器与设备

LC-20AT高效液相色谱仪(配有SPD-M20A二极管阵列检测器、SIL-20A自动进样器及CLASS-VP工作站) 日本岛津公司；SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵 巩义市英峪予华仪器厂；ZFQ-85A旋转蒸发仪 上海医械专机厂；B-260型恒温水浴锅 上海亚荣生化仪器厂。

1.4 色谱条件

色谱柱：SHIM-PACK VP-ODS C18(150mm× 4.6mm，5μm)；流动相：100%甲醇-5%甲酸溶液(5：95)；流速：0.8mL/min；进样量：20μL；检测波长：256、285、320nm；进行洗脱梯度。

1.5 蜂蜜多酚物质的提取

在Lihu等[10]的基础上进行了改进，具体步骤如下：取100g蜂蜜样品溶于500mL盐酸溶液(pH2)中，室温下磁力搅拌3min，溶解均匀后通过滤棉除去溶液中的固体颗粒。滤液与150g Amberlite XAD-2(孔径9nm，粒度0.3～1.2mm)树脂混合，磁力搅拌10min，使多酚物质被充分吸附。将树脂颗粒装入玻璃柱(55cm×3.0cm)中，用250mL盐酸溶液(pH2)冲洗柱子，之后用300mL蒸馏水漂洗柱子以除去全部糖类物质及其他杂质。用400mL甲醇将酚类物质洗出，并将洗脱液在45℃真空旋转蒸干(100r/min)，残留物用5mL水溶解，再用15mL乙醚分3次萃取。醚提取物混合后在30℃条件下去除乙醚，干渣用1mL甲醇复溶，0.45μm滤膜过滤后进样。

1.6 标准溶液配制

分别称取各标准品10mg置于10mL棕色容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，配成质量浓度为1.0mg/mL的标准储备液，并置于4℃冰箱中避光保存，其他质量浓度标准品由储备液稀释得到。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的确定

2.1.1 检测波长的选择

将15种标准品储备液配制成100μg/mL的单标工作液，分别在200～400nm波长范围内进行扫描，得出各对照品的紫外吸收峰，主要集中在256、280、285、320、360nm五个波长。在这5个波长下对75μg/mL的混合标准品进行检测，发现在256、285nm及320nm波长处的出峰数及分离效果最好，干扰最小，故选择这3个波长作为检测波长。

2.1.2 梯度洗脱条件的选择

图 1 256nm波长条件下两种流动相的标准品图谱对比Fig.1 Comparison of chromatograms of 15 standards at 256 nm with mobile phases A and B

参考陈滨等[11]的洗脱条件，考察甲醇-0.1%甲酸、甲醇-5%甲酸、5%甲酸甲醇-5%甲酸对15种混合标准品的分离情况。在35℃柱温条件下，以0.8mL/min的流速进样20μL，对3种流动相进行选择，发现甲醇-0.1%的甲酸不能将15种物质完全分离，仅能分离出12种物质；甲醇-5%的甲酸、5%甲酸甲醇-5%甲酸均可以使15种混合标准品完全分离，且峰形较好，考虑到柱子对酸的耐受程度，最终选择甲醇-5%甲酸作为流动相(图1)。

采用陈滨等[11]的洗脱条件进行洗脱，虽然可以使混合标准品得到较好分离，但是对蜂蜜样品的分离不是特别理想，多酚物质的保留时间短，于是对洗脱时间及流动相比例进行调整，确定洗脱梯度为时间0～6min时，对应甲醇体积分数2%～8%；6～10min，8%～15%；10～20min，15%～17%；20～30min，17%～32%；30～60min，32%～42%；60～70min，42%～50%；70～71min，50%～100%；72～7 7 m i n 用以平衡色谱柱，对应甲醇体积分数2%。

2.1.3 流速的选择

对0.5、0.8、1.0mL/min三个流速进行考察对比，发现0.5mL/min时，样品保留时间较长，1.0mL/min时压力比较大，综合考虑后确定0.8mL/min作为最终流速。

2.2 标准曲线的建立

分别取储备液适量，用甲醇配制成质量浓度为230、150、110、76.38、60、20、5、2.5μg/mL的混合标准溶液，按2.1节所确定的色谱条件进样分析，平行测定3次，以标准品含量为横坐标，以平均峰面积为纵坐标得到15条标准曲线(表1)。

表 1 标准曲线与相关系数Table 1 Standard curves with correlation coefficients

从表1可见，相关系数均大于0.995，表明在此质量范围内，各对照品质量浓度与峰面积相关性良好。

2.3 精密度实验

取质量浓度为76.38μg/mL的混合标准品，重复进样6次，求得各色谱峰相对峰面积的RSD在0.18%～1.45%之间，相对保留时间的RSD在0.09%～1.04%之间，色谱峰的个数及特征没有明显变化，精密度较好。

2.4 加标回收率实验

准确称取野桂花蜜100g，加入0.5mL的混合标准溶液，混匀后按1.5节的样品处理方法进行处理，并在1.4节的色谱条件下重复进样3次，测得回收率见表2。由表2可知，荔枝蜜中15种物质的加标回收率在92.4%～102.1%之间，说明本方法回收率较好。

表 2 野桂花蜜的加标回收率测定结果Table 2 Recovery rates of osmanthus honey

2.5 样品测定

根据前述的1.5节样品提取条件及1.4节色谱条件，对8种蜂蜜样品中的脱落酸及14种多酚进行测定，结果见图2及表3。

图 2 4种蜂蜜在256、320nm的图谱对比Fig.2 Chromatograms of four honey samples at 256 nm and 320 nm

由图2可知，不同蜂蜜在同一波长下所得图谱差别较大，其中野桂花蜜最为明显，除未知物G1外，其他物质峰值均较低；不同蜂蜜酚酸黄酮的分布不同，野桂花蜜出峰时间集中在30～55min，酚酸物质较少；枇杷蜜中黄酮酚酸种类较多，含有未知物G3、G4，分别在320nm及340nm有最大吸收，其中G2为混合物；枣花蜜中各物质分布比较均匀，其中F1峰值较大。对比枣花蜜、荔枝蜜可知，荔枝蜜中各物质吸收峰相对均较高，杨梅酮和脱落酸最为明显。

表 3 8种蜂蜜样品中脱落酸及14种多酚测定结果Table 3 Contents of flavonoids, phenolic acids and abscisic acid in honeys

由表3可知，不同蜂蜜所含的15种标准物质含量差别较大，枇杷蜜中α-儿茶素含量最高，杨梅酮次之；枣花蜜中阿魏酸、杨梅酮含量较高；椴树蜜中槲皮素最多，荔枝蜜中脱落酸最多；益母草蜜、野桂花蜜、紫云英蜜均含有较多的原儿茶酸；龙眼蜜中含有较多的阿魏酸、木犀草素，这与郭夏丽等[9]的结论一致。

同一种物质在不同蜂蜜中的含量差别也很大，就脱落酸而言，荔枝蜜、龙眼蜜中脱落酸含量最高，远高于其他蜜种，并均高于自身总酚酸含量；就酚酸而言，原儿茶酸与p-香豆酸分布相对比较均匀，而阿魏酸含量差别较大，在枣花蜜、荔枝蜜中最高，在野桂花蜜、紫云英蜜中含量较少；咖啡酸、没食子酸在8种蜂蜜中含量均较低；就黄酮而言，8种蜂蜜中杨梅酮及槲皮素含量相对较高，芹菜素、山奈酚的含量则较低，其中杨梅酮、槲皮素在荔枝蜜中含量最大，芦丁及木犀草素在龙眼蜜中最多；芹菜素在益母草蜜、紫云英蜜及野桂花蜜中未被检出。

由表3可知，不同蜜种总酚的含量差异较大，总酚酸总黄酮的比例分布也不同。荔枝蜜、龙眼蜜的总酚含量最高，均大于2000μg/100g蜂蜜，而野桂花蜜、椴树蜜的总酚含量则较低；龙眼蜜的总酚酸含量最高，占其总酚含量的28%，而荔枝蜜、龙眼蜜则含有最多的黄酮，分别占其总酚含量的80%、71%。

3 讨论与结论

酚酸黄酮作为微量活性物质，在不同植物中分布差异较大，可以利用其差异来进行植物来源的判别。脱落酸作为一种植物激素，在植物干旱、高盐、低温和病虫害等逆境胁迫反应中起重要的信号传导作用，其含量变化与植物的种类及生长环境密切相关[12]。

目前，国内外对蜂蜜中多酚的研究较多，并已用于单花蜜的蜜源判别及掺假检测。李菁等[8]对刺槐蜜的3种酚酸进行研究，王文静[13]对洋槐蜜中的3种黄酮进行检测，制定了洋槐蜜黄酮化合物指纹谱图。周梦遥[14]对油菜蜜、向日葵蜜中的10种多酚进行检测并制定相关图谱。Lihu等[15]对澳大利亚5个植物属的16种蜂蜜进行了黄酮类物质的分析，得出利用总黄酮含量来区分蜜种的结论。Mustafa等[16]对马来西亚蜂蜜中的多酚物质进行分析，并对其抗炎性进行研究，证实不同蜂蜜中多酚物质含量不同，抗炎作用也不同。Isabel等[17]对西班牙地中海沿岸60种柑橘蜜及柠檬蜜的10种多酚物质及37种挥发性物质进行分析，成功区分出两种蜂蜜。本实验对8种蜂蜜的14种多酚进行分离检测，为单花蜜的蜜种识别及活性成分分析提供依据。

把脱落酸的检测与蜂蜜蜜源识别相结合的研究在国内较少，国外则相对成熟。Federico等[3]确定脱落酸为石楠花蜜的主要成分，并将其用于单花蜜的蜜源判断。Lihu等[4]将脱落酸作为桉树蜜地理来源的判别物。Izabela等[18]测定了土耳其石楠花蜜及荞麦蜜中的脱落酸及酚酸，将总酚酸的含量与与脱落酸含量作为两种蜂蜜植物来源的判别标准。Jasna等[19]利用液-质联用技术对斯洛维尼亚7种蜂蜜中的脱落酸及黄酮进行了研究，用其含量及组成来区分7种蜂蜜。本实验依据脱落酸及多酚含量高低，将脱落酸、杨梅酮及总酚含量作为荔枝蜜的检测标准，将咖啡酸、α-儿茶酸含量作为枇杷蜜的判别标准；3,4-二甲氧基肉桂酸、木犀草素及脱落酸含量作为龙眼蜜的检测标准，将芦丁及山奈酚含量作为益母草蜜的检测标准，α-儿茶酸、芹菜素作为枣花蜜的检测标准，原儿茶酸作为紫云英蜜的检测标准。这些研究结果进一步表明将脱落酸的测定与多酚测定相结合将成为识别蜂蜜种类、鉴别单花蜜掺假的有效方法。

本实验虽然成功分离鉴别出了14种多酚，但研究过程中标准物质种类有限，尚有多酚物质未能确定，这需要结合质谱分析进行进一步的判断。同时，采集样品的数量有限，有关产地来源的分析及指纹图谱的建立，还需要搜集不同地区的同种蜂蜜作进一步的研究。

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