抗雌激素药物的尿中代谢产物的检测和鉴定分析

杨阳

(黑龙江护理高等专科学校 黑龙江哈尔滨 150000)

本文旨在探讨分析抗雌激素药物他莫昔芬的尿中代谢产物的检测和鉴定,具体报告如下:

1 仪器与试药

(1)仪器。气质联用仪生产厂家Agilent,型号5973/6890;色谱柱为HP-1气相色谱柱(毛细),长度17m,内径200μm,厚度0.11μm,5%苯基交联甲基聚氧硅烷;载气为0.9ml/min流速的氦气;柱头压力为113kPa;进样口设定温度为280℃;检测接口设定温度为290℃;升温程序为初始温度180℃,以3.3℃/min提升至231℃,后以30℃/min提升至310℃,2分钟保留;进样方式为分流进样,以1:8.9为分流比,以10ml/min为分流口流速;进样体积为2μl;质谱电离方式为EI,电子能力为70ev;采集模式为全范围扫描m/z 50-650amu[1]。

(2)试药。他莫昔芬:阿斯利康白色片剂,由英国捷利康公司生产,每片含15.2mg枸橼酸他莫昔芬(即10mg他莫昔芬)。

(3)阳性尿样收集。选取20名健康的男性志愿者,在服用药物之前收集2次尿液,于清晨空腹状态下服用药物,在服用药物后的72小时内收集各次排尿,和72小时后的4天内的晨尿,对每次排尿的体积和时间进行记录。志愿者服用他莫昔芬的剂量为1片阿斯利康白色片剂(即10mg他莫昔芬)。

(4)阳性尿样前提取方法。提取所有志愿者服用药物之前尿样和服用药物36小时后的尿样各5ml,pH值在6.4-6.7范围。以固相萃取-酶解-液相萃取-气质联用仪上样分析的前提取方法处理。具体操作为:将尿样(5ml)置于试管内,在离心后收集上清液放置在C18柱之上,用水(5ml)对柱床洗涤,再用甲醇(4ml)洗脱,收集洗脱液放置在旋转蒸发仪上,以50℃讲甲醇蒸出。在蒸干物至放入加pH值6.8的磷酸盐缓冲液(1ml)及β-葡萄糖醛酸甙酶(50μl),在涡旋混匀后,放置在55℃的水浴箱中进行3小时酶解,在酶解完成后,将试管取出,放入固体缓冲盐(0.1g),将pH值调至8.8,放入叔丁基甲醚(5ml)进行萃取,再放置在涡旋振荡器上进行1分钟混合,以2500rpm进行5分钟离心,以吸管收集上层的醚液,放置到干燥的试管内,在氮气(65℃)下将其吹干,使用气质联用仪上样分析[2]。

(5)他莫昔芬的尿中代谢产物结构鉴定。对代谢产物标准品的合成,经EI与CI对比进样分析、高分辨质谱对分子量测定并拟合分子式、串联质谱到离子谱来分析。以气相色谱与高分辨质谱联用,经色谱柱分离样品后,在不同的时间进入到高分辨质谱中,用精确质量(PFK峰)对测量到的质量数进行校准,使用计算软件得出元素组成。

2 结果

表1 尿中原型和代谢产物的检出情况

(1)尿中代谢产物检测情况。结果显示尿中代谢产物主要为结合型葡萄糖醛酸,少数为游离型葡萄糖醛酸(不稳定)。尿样经过酶解后提取,在提取的离子色谱图可见代谢物峰。同时和提取的服用药物之前尿样的离子色谱图对比,发现17.54分钟为代谢物峰,即雌激素药物他莫昔芬尿中主要代谢产物Met.C,分子量是417。在17.30分钟发现另外一个较低的代谢物峰,分子离子为473,此代谢产物为Met.U,即抗雌激素药物他莫昔芬的尿中代谢产物主要为Met.C与Met.U。尿中原型和代谢产物的检出情况,详见表1:

(2)他莫昔芬的尿中代谢产物结构鉴定。结果发现他莫昔芬的尿中代谢产物的元素组成是C30H39O3NSi,在EI与CI的谱图上可见m/e489(M+)与m/e490(M+1),证实MSTFA的产物分子量为489。

3 讨论

抗雌激素药物,即雌激素受体的抑制剂,是对雌激素受体作用的一类药物,该药物能够和雌二醇争夺雌激素受体,发挥阻断雌激素的作用。临床主要应用该药物治疗乳腺癌、不孕不育症等和激素有关的疾病。但近年来,滥用兴奋剂者将该药物用于男性参加的体育竞赛当中,使体内的睾酮水平提高,同时对抗服用了外源性的类固醇所产生的副作用。IOC在2003年颁布的禁用物质和禁用方法表中明确规定男性禁用抗雌激素药物(他莫昔芬,氯米芬,环芬尼)[3]。为了建立常规检测抗雌激素药物他莫昔芬阳性尿样的方法,对抗雌激素药物他莫昔芬的尿中代谢产物进行结构鉴定,我们选择他莫昔芬作为研究药物,对该药在尿中的代谢产物进行检测和鉴定分析。本研究通过GC/MS技术检测和鉴定抗雌激素药物他莫昔芬的尿中代谢产物。检测结果证实,志愿者服用药物后的排出的尿液中只有少量的他莫昔芬代谢产物提示该药在体内代谢广泛,但不经尿液排出,而是通过胆汁排出。他莫昔芬是三苯氧胺结构药物,脂溶性相对较高,极易通过肾小管重复吸收,长期停留在体内。另外,该药在体内的代谢还进行肝肠循环,在以葡萄糖醛酸甙的形式进入胆汁,肠道吸收较慢,经β-葡萄糖醛酸水解酶的水解成原型,使脂溶性增大,又经肠道吸收进入到门静脉,使尿液中的代谢产物存留时间延长,单剂量服用该药物,在20天后仍可检出。

综上所述,采用GC/MS技术检测和鉴定抗雌激素药物他莫昔芬的尿中代谢产物准确可靠,抗雌激素药物他莫昔芬的尿中代谢产物主要为Met.C,分子式C27H31NO3,分子量417。

[1]刘先军,张晶,邵兵,等.固相萃取-液相色谱串联质谱法测定城市污水中他莫昔芬和来曲唑[J].分析化学,2012,38(2):214-218.

[2]马宗会,樊在霞,聂华丽,等.他莫昔芬微胶囊的制备及体外药物释放性能研究[J].中国药学杂志,2008,43(16):1248-1251.

[3]张倩,朱余兵,于翠霞,等.枸橼酸他莫昔芬分散片在健康人体的药动学和生物等效性研究[J].中国临床药理学与治疗学,2008,13(3):303-307.