HPLC法测定30个荞麦品种芦丁含量的研究

郭 彬，韩渊怀，黄可盛，路 阳，侯思宇

（山西农业大学生物工程研究所，山西太谷030801）

荞麦属蓼科（Polygonaceae）荞麦属（Fagopyrum Mill），品种主要有甜荞（F.esculentum Goerth）和苦荞（F. tararicum Gaerth）2个栽培种以及金荞麦（F.dibotrys（D.Don）Hara）1个野生种[1-2]。荞麦属于药食两用植物[3]，其含有极为丰富的天然生物活性成分黄酮类物质——芦丁[4]。芦丁（quercetin 3-O-b-D-glucose-[1，6]-O-a-L-rhamnose，rutin）又称维生素P，是某些中草药的有效成分，具有抗紫外线、抗血栓形成、糖尿病辅助治疗、降低毛细管通透性和脆性以及癌症的辅助治疗等作用[5-6]。国内外医药工业已经成功开发了曲克芦丁、维脑路通（羟乙芦丁）等以芦丁为主要原料的药物，并在临床治疗上取得了良好效果[7]。目前，我国用于芦丁提取的原料主要为槐米，而槐米因原料不足，已远不能满足市场需求，开发多元化的芦丁来源，补充市场需求尤为重要。荞麦生长期短（70～90 d），抗逆性强，一年四季均可种植[8]，这些特性为荞麦成为芦丁的来源提供了可能。

本研究共选取30个不同产地的甜荞和苦荞品种，对其花、叶、茎组织中的芦丁含量进行分析，旨在为进一步培育高芦丁含量的荞麦品种、加快荞麦芦丁相关产品研发奠定基础。

1 材料

1.1 植物材料

30个荞麦品种由山西省农业科学院小杂粮研究中心提供（表1）。5月20日播种于山西农业大学农作站，盛花期分别选取适量健康花、叶与茎组织于培养皿中，80℃烘箱干燥10 h。将干燥后的组织置于研钵中研成粉末，并精确称取0.1 g组织，待用。

1.2 仪器与试剂

安捷伦Series1100高效液相色谱仪（美国）；赛多利斯电子分析天平（德国）；芦丁标准样（Sigma，纯度≥95%）；甲醇为色谱纯（Fisher，美国）；实验用水为纯净水。

表1 不同荞麦品种

2 方法与结果

2.1 色谱条件

安捷伦C18柱（150 mm×4.6 mm，5μm），柱温30℃，流动相为甲醇∶水（V/V）＝46∶54，流速1 mL/min，进样量5μL，检测波长257 nm，按上述色谱条件分析，每个样品重复3次。对照品与九江苦荞色谱如图1所示。

2.2 对照品溶液配制及线性关系考察

精密称取经减压干燥的芦丁标准品0.05 g，加入10 mL甲醇定容至质量浓度为5 mg/mL的母液。精确吸取10μL母液，加入1 mL甲醇，稀释成50μg/mL，依此类推，将标准样品稀释成50～400μg/mL质量浓度梯度。按2.1色谱条件上样测定峰面积，按照峰面积（x）与对应的标准品浓度（y）计算线性回归，得到芦丁标准曲线（图2）：y＝0.09x＋20.913（R2＝0.997 3），不同样品芦丁质量浓度按此公式计算。

2.3 供试品溶液配制

称取荞麦各组织干燥样品0.1 g包入滤纸内，放入索氏抽提器，加入甲醇，加热回流，直到样品为无色，获得提取液；再经0.45μm滤膜过滤，精确量取提取液100μL，将提取液定容至1 mL，将此样品按2.1色谱条件进行分析，记录峰面积。

2.4 精密度试验

选取同一浓度芦丁对照品，重复进样6次，测得芦丁峰面积值的RSD为0.8%，表明仪器精密度较好。

2.5 稳定性试验

选取九江苦荞叶组织，在24 h内每隔2 h重复进样一次，记录峰面积，供试样品峰面积RSD为1.4%，表明样品的稳定性较好。

2.6 重复性试验

选取九江苦荞叶组织样品6份，每份0.1 g，按2.3方法配制供试样品溶液，按2.1色谱条件进行分析，记录峰面积，芦丁峰面积RSD为1.2%，表明样品重复性较好。

2.7 加样回收率试验

选取已知浓度的九江苦荞叶组织样品6份，每份0.1 g，按样品量的80%，100%，120%加入对照品溶液，按2.1色谱条件进行分析，记录峰面积，计算平均回收率。由表2可知，6份样品加样回收率平均值为99.98%，且RSD为1.38%。

表2 芦丁加样回收率

2.8 样品含量测定

按2.3方法处理荞麦各组织样品，按2.1色谱条件分析，记录峰面积，根据浓度计算公式、提取体积、稀释倍数及样品重复计算得出30个荞麦品种的芦丁含量（mg/g），所得结果列于表3。结果显示，试验所检测的30个荞麦品种，花、叶、茎中芦丁含量最高的品种分别是西农9940、威苦01-374和KQ08-02，均为苦荞，其含量分别为60.91，50.66，11.35 mg/g。所测试的荞麦品种花和叶中含量相差可达10倍，表明品种间不同组织的芦丁含量存在明显差异（P＜0.01）。所测试的甜荞品种花中芦丁含量平均值为33.67 mg/g，而苦荞品种花中芦丁含量平均值达到50.03 mg/g。

表3 不同荞麦品种各组织芦丁含量测定 mg/g

续表3 mg/g

3 讨论

3.1 提取方法与检测条件

以往对于荞麦芦丁提取所用试剂，均采用60%～70%的乙醇或甲醇提取，而本试验直接采用流动相甲醇提取，相比乙醇提取样品的稳定性及试验重复性较好。张琪等[9]在荞麦芦丁提取的试验中也得到了相同的结论。

应用HPLC法检测芦丁含量，主要是控制流动相比例及检测波长。根据《中华人民共和国药典》中有关芦丁的测定，采用流动相甲醇∶1%冰醋酸为32∶68，也有研究采用甲醇∶水（V/V）为35∶65或甲醇∶水∶乙酸（V/V/V）为45∶53∶2的配置[10-12]。本试验经过反复调试，将流动相比例设置成甲醇∶水（V/V）为46∶54，仪器运行良好，取得了较好的试验结果。对于检测波长，芦丁在204，257，355 nm处有3个吸收峰，查询《中华人民共和国药典》中芦丁的检测波长为257 nm，本试验也采用257 nm波长进行检测，效果良好。

3.2 品种间芦丁含量差异分析

从不同荞麦品种各组织芦丁含量测定结果可以看出，所有供试品种中花的芦丁含量明显高于其他组织。其中，茎中芦丁含量相比其他组织较低，在生产应用中，不适用芦丁开发的进一步研究。唐宇等[13]对荞麦总黄酮含量的测定也证实，荞麦中总黄酮含量大小依次为花＞叶＞种子＞茎。

考量30个品种各器官芦丁含量，所测试的苦荞品种整体高于甜荞，仅有甜荞品种（云引1号）花中芦丁含量达到53.88 mg/g，高于苦荞花中芦丁含量的平均值，这为进一步筛选高芦丁含量的甜荞品种提供了良好的参考。西农9940花中芦丁含量最高（60.91 mg/g），但叶中含量较低（26.52 mg/g）。综合考察，九江苦荞花和叶中的芦丁含量较高，分别为53.22，47.14 mg/g。尽管所测试荞麦品种花比其他器官芦丁含量高，但其花器小、产量低、无限花序等特点，成为开发利用荞麦芦丁的限制瓶颈。本试验全面分析了甜荞和苦荞品种间各器官芦丁含量的差异表现，筛选出高芦丁含量的甜荞和苦荞品种，为进一步荞麦品种选育提供参考。并且本试验还发现，一些荞麦品种叶片中也有较高的芦丁含量，例如美混选、九江苦荞、KQ080-02、黔苦4号以及黑丰1号等品种芦丁含量均在40 mg/g以上。这为选育高芦丁含量的品种提供了新视野，可定向选育叶片芦丁含量较高的品种，用以解决生产上芦丁来源途径狭窄的问题，并为全面开发利用苦荞各器官提取芦丁提供了有价值的参考。

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