等离子体注入枣树接穗的诱变试验

陈红玉，马光跃，郝学金，申仲妹

（1.山西省农业科学院园艺研究所，山西太原030031；2.山西省农业科学院旱地农业研究中心，山西太原030006）

早在20世纪80年代，我国水稻育种工作者就已开始利用等离子体注入水稻品种，获得了损伤轻、突变率高、突变谱广的统计结果，证实了其作为诱变育种的一种新的诱变源是切实可行的、有效的[1]。等离子注入诱变主要设备是离子注入机，利用高压加速的气体离子轰击目标材料，使之产生突变，极大地增加了生物基因的突变几率，缩短了作物改良时间，减少了育种的工作量[2-4]。岳洁瑜等[5]通过对胚珠DNA的SSR标记分析，在DNA水平上检测氮离子束诱变后胚珠的多态性变化，结果表明，离子注入陆地棉花花粉后再给雌蕊授粉，会对胚珠的DNA多态性产生影响，在一定程度上改变花粉中精细胞的DNA序列。马海林等[6]研究不同剂量N+注入对菜用大豆出苗率及后代遗传变异的影响，结果表明，诱变后代变异可能出现在诱变当代，也可能出现第2代中，因此，进行变异选择时建议从第2代以后开始。徐明照等[7]用N+束注入玉米H65和H14D种子，研究其M1的细胞学效应，结果表明，离子注入不仅能够诱发M1根尖细胞核和染色体畸变，而且还能诱发染色体出现多种变异类型；其畸变频率随离子注入剂量的增加而增大。山西省农业科学院自从俄罗斯引进等离子注入设备以来，经诱变处理已育成品黍1号[8]、品黍2号[9]、晋荞麦（苦）4号[10]等一批农作物新品种及新种质材料，然而经查新，该技术在果树诱导芽变领域尚未见成功的报道。本试验通过对枣树接穗的等离子体注入，探索枣树诱变育种的新途径。

1 材料和方法

1.1 供试材料

供试枣树接穗为骏枣、壶瓶枣、葫芦枣和大荔龙枣接穗；石蜡；宽度1.5 cm的防水耐高温胶纸。供试设备为山西省农业科学院旱地农业研究中心真空等离子体注入机，供试气体是高纯氮，处理后的接穗嫁接于山西省农业科学院园艺研究所枣苗圃。

1.2 试验方法

1.2.1 接穗准备 供试接穗于2012年3月中旬采集，将健壮枣头枝中段部分剪成单芽接穗，随即在100～120℃的石蜡中快速浸蘸进行保水处理，蜡封后的接穗置于冷藏柜冷藏；等离子体注入前供试接穗用防水耐高温胶带纸严密缠裹2层，仅露出被辐照的芽体部分。

1.2.2 处理剂量 将准备好的接穗放入样品盘固定，被照芽体朝上，送入离子注入机进行处理。注入气体为氮气（用N+表示数量），诱变剂量设3个处理，A.4×1016个/cm2；B.6×1016个/cm2；C.8×1016个/cm2。注入速度为10 mA×30 kV，靶室真空度为4×10-4MPa，每处理24个重复。对照接穗浸蜡缠绕胶带纸，不进行等离子注入。样品处理完毕后用湿毛巾包裹放入冷藏柜冷藏，待5月初将处理后的接穗缠裹物去除，用切接法嫁接，当日嫁接完毕，挂牌标记以备调查。

1.2.3 调查内容及方法 （1）萌动率。嫁接后每2 d观察各处理萌动情况，统计萌动数，萌动的标准为主芽露出绿尖即确定为萌动。（2）生长情况。接穗萌动后每5 d测量一次所有新梢生长长度，待新梢停止生长后，计算每处理株的生长期。（3）变异情况。包括叶片大小、枝条分布等综合状况。对有明显变异的单株进行拍照及取样比较。

2 结果与分析

2.1 不同处理对各品种枣树接穗萌动率及萌动时期的影响

表1 不同处理对各品种萌动率的影响 %

从萌动率来看，各品种对照的萌动率均高于其他处理，其中，壶瓶枣和大荔龙枣对照萌动率显著高于处理B、处理C，骏枣和葫芦枣对照萌动率显著高于其他3个处理（表1）。说明离子注入过程中可杀死部分接穗芽体，致使其无法萌动。

从萌动期早晚及集中度来看（图1），各品种对照接穗萌动普遍早于诱变处理，而且CK＞A＞B＞C。对照萌动的集中度最高，曲线有明显的峰值，其次为处理A、处理B，处理C峰值最不明显。说明离子注入过程中，随着注入强度的增加，对芽体造成的损伤在加大，接穗芽体自愈需要时间越长，芽体恢复萌动能力的时间越长。

2.2 不同处理对各品种枣头枝生长的影响

调查发现，各品种新梢在8月26日已全部停止生长，比较各品种不同处理新生枣头长度，发现除骏枣处理A、处理C间存在显著差异外，其他品种各处理间差异均不显著。说明尽管离子注入对芽体产生了生理损伤，使芽体萌动受到影响，但对芽体萌动后的生长并未产生明显影响（表2）。

表2 不同处理对各品种枣头枝生长量的影响 cm

2.3 不同处理对各品种枣树生长期的影响

新梢生长期是枣树的主要生物学指标，与果实成熟期有重要关系。本试验表明，枣头枝最早停止生长在7月10日，最晚在8月26日，相差46 d。为分析离子注入对枣头枝生长期的影响，统计了各品种枣头枝生长期长短，结果显示，壶瓶枣C处理枣头枝生长量与对照间存在显著差异，且平均生长天数处理C＞CK；骏枣平均生长天数处理A与处理B，C间存在显著差异，且处理A＞B＞C；葫芦枣、大荔龙枣各处理间差异不显著。说明N+注入对枣头枝生长期有影响，但不同品种对不同剂量的响应存在差异（表3）。

表3 不同处理对各品种枣头枝生长天数的影响 d

2.4 不同处理对枣树变异的影响

试验中所有枣树只有2株有果，尚看不出离子注入对果实变异的影响，但在调查中发现，壶瓶枣处理C有2株叶片明显大于壶瓶枣其他处理，排除水肥条件、边际效应可能引起的饰变，这2株壶瓶枣苗确实为离子注入产生的变异。表4为其中一变异株叶片与对照叶片的比较，可以明显看出，对照叶片的面积明显小于变异株，且二者间差异显著。

表4 壶瓶枣变异株叶片与对照叶片的比较

3 讨论

3.1 等离子注入枣接穗的处理方法

等离子注入环境为低压高温环境，适宜剂量处理含水量低的作物种子不会全部杀死种子；而枣接穗含水量高，曾尝试对浸蜡保水后的枣接穗进行小剂量注入处理，结果接穗全部失水死亡，为此，本试验用双层防水耐高温胶带纸严密缠裹接穗，只露出被辐照的芽体部分，并以芽体为靶进行集中注入，取得了成功。我们还对苹果、葡萄接穗采用此法进行等离子注入，同样取得了成功，为果树接穗诱变处理探索出一种新的方法。

3.2 不同品种对诱变剂量的响应

吕杰等[11]研究表明，N+注入剂量之间与2个苜蓿品种之间存在差异，不同剂量的影响要比2个不同品种影响大。离子束诱变育种及品质改良中，应针对不同品种、不同处理目的灵活设计合适的剂量范围与梯度，并采取不同处理方式。那日等[12]研究N+注入对紫花苜蓿幼苗生长和营养成分的影响表明，注入剂量为2.08×1016～8.32×1016个/cm2时，发芽率随注入剂量加大，种子发芽率存在增加、平缓、下降直至降为零的过程。以上研究结果显示，不同物种种子发芽率或出苗率对诱变剂量的响应不尽相同，但多数物种在合适剂量处理下可以提高种子发芽率或出苗率。本试验结果显示，不同品种的萌芽率对诱变剂量的响应不尽相同。在各品种枣头枝生长量的比较中，除骏枣处理A和处理C枣头枝生长量间存在显著差异外，其他品种各处理间均不存在显著差异。在枣头枝生长期的比较中，壶瓶枣处理C与CK间存在显著差异，骏枣处理A与处理B，C间有显著差异，而葫芦枣及大荔龙枣各处理间差异不显著，说明葫芦枣和大荔龙枣对本试验所设诱变剂量响应不明显。初步分析以为，试验中所设诱变剂量处理较少，注入强度较轻，且未达到致死剂量，有必要在今后的试验中在更大剂量范围内优化注入参数，以进一步提高突变率。

3.3 不同诱变剂量对枣树变异的影响

在诱变调查中发现，壶瓶枣处理C中有2株突变，其中1株主要表现为叶片明显变大，另1株没有枣头，只有3个枣吊，1个枣吊直立生长，长度达58 cm，叶片也明显增大。也有骏枣个别株生长极慢或过早停止生长的现象，是否为变异，尚无法判断。本研究所处理苗木2013年才可以结果，有关果实等经济学及其他生物学性状变异需要进一步观测。

［1］王学栋，吴跃进，刘贵付，等.离子注入在水稻育种上的应用研究简报[J].安徽农业科学，1988，37（3）：9.

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［3］王敏，陈青云，陈光良.大气压等离子体处理对生菜种子萌发和生长发育的影响[J].华北农学报，2007，22（6）：108-113.

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［5］岳洁瑜，杨郁文.N+离子注入陆地棉花粉对胚珠DNA及M1代cDNA表达的影响[J].核农学报，2009，23（1）：54-59.

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［7］徐明照，周立人，程备久.氮离子注入玉米种子的细胞生物学效应[J].中国农学通报，2007，23（11）：77-80.

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［9］李梦.黍子新品种“品黍2号”在山西问世[J].农村百事通，2012（6）：13.

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