消渴降糖胶囊中总黄酮含量测定

2013-12-23高亚雄毕小平赵正保

山西卫生健康职业学院学报 2013年3期

高亚雄，李芸，毕小平，赵正保

(1.山西医科大学公共卫生学院，山西太原 030001;2.山西医科大学药学院，山西太原 030001)

消渴降糖胶囊的主要原料为番石榴叶。番石榴叶中主要化学成分有黄酮类化合物、鞣质类化合物、挥发油、植物固醇、叶绿素和多糖等［1，2］，其中黄酮类化合物以其广泛的药理作用倍受关注。近10 年来，有关黄酮类化合物的文献成指数增加，研究发现黄酮具有抗心脑血管病、抗氧化、镇痛、抗病毒、抗肿瘤、免疫调节、缓解糖尿病并发症等作用。本实验采用硝酸铝比色法测定总黄酮的含量，以芦丁为对照品，5%亚硝酸钠、10%硝酸铝和5%氢氧化钠溶液的用量分别为400 μL、400 μL、5 mL，显色时间20 min，于500 nm波长处测定消渴降糖胶囊提取物总黄酮的吸光度，并计算浓度及含量。在确定含量测定方法的前提下，实验进行了精密度、稳定性、重复性、加样回收率的实验考查，证明该含量测定方法的准确可靠性，以及提取样品的稳定性。

1 材料与仪器

1.1 材料

消渴降糖胶囊为山西华康药业股份有限公司生产，批号:20091001，20091002，20091003 ;芦丁标准品为中国药品生物制品检定所生产，批号:0080－9705;亚硝酸钠氢氧化钠为天津市津北精细化工有限公司生产;硝酸铝为天津市恒兴化学试剂制造有限公司生产。

1.2 仪器

UV-9100 紫外可见分光光度计(北京瑞利分析仪器公司)，TU-1901 双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)，KMD 型可调电子控温电热套(山东省鄄城县新华仪器厂)，电子天平(上海恒平科学仪器有限公司)，数字恒温水浴锅(常州国体电器有限公司)，日本岛津SHIMADZU 电子天平AUY120。

2 方法与步骤

2.1 含量测定方法

采用硝酸铝比色法。以芦丁作对照，于500 nm波长处测定［3，4］。

2.2 溶液制备

2.2.1 供试品溶液制备取装量差异项下的本品内容物，混匀，精密称定0.1 g，置具塞锥形瓶中，精密加入50%乙醇溶液25 mL溶解，密塞，称定重量，于75 ℃超声处理(70 W，40 kHz)60 min，放冷，再称定重量，用50%乙醇溶液补足减失的重量，摇匀、抽滤，再经微孔滤膜(0.45 μm)滤过，取续滤液即得，备用。

2.2.2 对照品储备液的制备精密称取芦丁对照品20 mg，置于10 mL的具塞刻度试管中，加入95%的乙醇溶液6.0 mL，微热使其溶解。再用95%的乙醇定容至刻度，摇匀，得到浓度为2.0 mg/mL的芦丁对照储备液，临用前稀释成0.2 mg/mL。

2.3 影响因素考察

2.3.1 最大吸收波长的选择取适量芦丁对照品溶液，在400 ～650 nm波长范围内进行扫描，测得的最大吸收波长为500 nm。见图1。

图1 芦丁对照品的吸收光谱Fig 1 Absorption Spectrometry of Control Substance of Rutin

2.3.2 亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠用量考察采用单因素考察法，以芦丁为对照品，95%的乙醇为溶剂，在500 nm处测定其吸光度，分别考察5% 亚硝酸钠、10%硝酸铝、5%氢氧化钠溶液的用量，确定各自最佳体积。见表1 ～3。

表1 显示，当亚硝酸钠体积是400 μL时，吸光度值最大，所以，亚硝酸钠用量选择400 μL为宜。

表2 显示，当硝酸铝用量是400 μL时，吸光度最大，所以，硝酸铝用量选择400 μL为宜。

表3 中1 号试管生成红色絮状物，非透明澄清溶液，不稳定，无法测得吸光度，所以只用了2 ～7 号试管。表3 显示，随着氢氧化钠用量的增加，吸光度先增加后减小，当氢氧化钠用量达5.0 mL时，吸光度值最大，所以，氢氧化钠用量5.0 mL为宜。

2.3. 3 显色时间考察取浓度为0.024 mg/mL 和0.040 mg/mL的芦丁对照品溶液，按照含量测定项下操作，室温放置0 min、10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、70 min，500 nm波长处测定吸光度，进行稳定性实验，结果见表4。表4 显示，显色时间在20 min后，吸光度值基本不变，因此确定显色时间为20 min。

表1 亚硝酸钠用量的影响Table 1 Effect of the Dosage of Sodium Selenite

表2 硝酸铝用量的影响Table 2 Effect of the Dosage of Aluminum Nitrate

表3 氢氧化钠用量的影响Table 3 Effect of the Dosage of Sodium Hydroxide

表4 不同浓度吸光度显色时间比较Table 4 Comparison of Absorption Coloration Time in Different Concentrations

2.4 标准曲线的绘制

精密吸取浓度为0.2 mg/mL的芦丁对照品溶液0 mL、0.4 mL、1.2 mL、2.0 mL、3.2 mL、4.0 mL，分别置于编号为0 ～5 的10 mL具塞试管中，再分别加入5%亚硝酸钠溶液400 μL，混匀，放置6 min，再加10%硝酸铝溶液400 μL，放置6 min，再加5% 氢氧化钠溶液5.0 mL，最后用95%的乙醇定容至刻度，摇匀，20 min后，以0 号为空白，在500 nm处测定其吸光度。

以芦丁的浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，得回归方程为:y = 11. 301x + 0. 012，(n= 5)，芦丁在0.008 ～0.080 mg/mL范围内线性良好，R=0.996 9。结果见图2。

图2 芦丁标准曲线Fig 2 Rutin Standard Curve

2.5 精密度试验

取高、中、低3 种不同浓度对照品溶液，按照含量测定方法项下操作，于日内8:00，12:00，20:00 测定其吸光度，结果见表5。

表5 日内精密度结果Table 5 Precision Result in a Day

由表5 可知，高、中、低3 浓度的日内精密度试验测定结果的RSD 为1.4% ～2.0%。结果表明，该方法的日内精密度良好。

2.6 稳定性试验

精密称取批号为20091001 的消渴降糖胶囊样品，按供试品溶液制备方法制备，室温放置，分别于0 h、1 h、2 h、4 h、6 h、12 h进行测定，结果见表6。

表6 稳定性试验结果Table 6 Test Result of Stabilization

表6 显示，12 h 内，测定结果为均值0.417 ±0.008，RSD 为2.0%，表明供试液在12 h内基本稳定，可以满足测定要求。

2.7 重复性实验

精密称取同一批号为20091001 的消渴降糖胶囊样品，按供试品制备方法平行制备6 份，分别测定吸光值，计算相对标准偏差，测定结果均值(94.35 ±4.29)mg/g，RSD 为4.5%，结果见表7。

表7 重复性实验结果(n=6)Table 7 Results of Repeated Experiments(n=6)

由表7 可知，测定结果的RSD 值小于5%，说明此方法重复性良好。

2.8 回收率实验

采用加样回收率试验法。称取已知含量的批号为20091001 的消渴降糖胶囊6 份0.05 g，精密称定，分别精密量取对照品溶液6 份(100%)，按照供试品溶液制备方法制备并测定其吸光度，计算回收率。结果见表8。由表8 可知，回收率在95.6% ～104.9%之间，RSD 值小于5%，表明该方法准确度良好。

表8 回收率实验Table 8 Percentage Recovery Tests

2.9 样品含量测定

2.9.1 溶剂的选择由于黄酮类化合物具有相对较高的亲水性，溶于乙醇、甲醇等，同时考虑到甲醇毒性较大［5］，结合文献，分别使用水，正丁醇和50%、70%、95%的乙醇按照供试品制备项下操作，进行比较预实验，考察溶剂的影响，结果见表9。由表9 可知，50%的乙醇提取效果最佳，因此选用50%的乙醇作为本实验的提取溶剂。

2.9.2 正交设计提取样品中总黄酮含量的方案［6～8］正交设计提取样品中总黄酮含量的方案见表10。精密称取供试品0.1 g，根据表10 正交设计安排，分别按照供试品项下操作进行超声处理，之后抽滤，再用95%乙醇定容至10 mL，取0.5 mL按照含量测定项下方法进行测定，结果见表11。

表9 溶剂的选择Table 9 Solvent Choice

表10 因素水平表Table 10 Level Table of Factors

表11 正交试验及结果Table 11 Orthogonal Experiment and Results

2.9.3 最佳配方的确定由表11 直观分析K 值可得，提取样品中总黄酮最佳方案为A2B3C1，即1∶250的料液比75 ℃超声处理60 min。由R 值可知，在对影响样品中总黄酮提取的3 个因素中，提取温度对其影响最大，其次为料液比，影响最小的为提取时间，即C ＞A ＞B。

2.9.4 3 批样品中总黄酮含量的测定分别精密称取3 个批号的待测样品0.1 g，依据供试品溶液制备项下的方法制备供试品溶液，按照含量测定项下方法进行含量测定，计算含量。结果见表12。结果表明:所提供3 批样品的总黄酮平均含量为87.95 mg/g。

表12 3 批样品的总黄酮含量Table 12 Content of Total Flavone in Three Batches of Samples

3 结果

本实验采用正交设计法优选消渴降糖胶囊中总黄酮的提取工艺，最终确定提取样品中总黄酮的最佳方案为以1∶250 的料液比，用50%乙醇，75 ℃超声处理60 min;并用硝酸铝比色法测定总黄酮的含量，以芦丁为对照品，亚硝酸钠、硝酸铝和氢氧化钠的用量分别为400 μL、400 μL、5 mL，显色时间20 min，于500 nm波长处测定消渴降糖胶囊提取物总黄酮的吸光度，并计算浓度及含量;在确定含量测定方法的前提下，实验进行了精密度、稳定性、重复性、加样回收率的试验考察，证明该含量测定方法的准确可靠性，以及提取样品的稳定性，并测得消渴降糖胶囊中总黄酮的含量不得少于74.76 mg/g。