应用黄金分割法优选小球藻的培养温度

刘志媛, 周俊如, 崔玉兵, 郑阵兵, 王 珺

(海南大学 海洋学院, 海南 海口570228)

微藻是一类个体微小的单细胞或多细胞植物, 能够有效地利用太阳能, 通过光合作用将无机物转化为脂类、蛋白质、多糖及色素等高附加值的代谢产物。微藻用途广泛, 不仅是鱼、虾、贝类幼体或成体的直接或间接的活饵料, 还是药品和保健品的原料[1]。此外, 含油量高的微藻被认为是生物柴油的理想生物原料[2-4]。

海南光热充足, 微藻资源丰富, 具有开发微藻产业的巨大优势。筛选微藻资源, 研究其生物学性状, 优化其培养条件, 是微藻资源开发和利用的必要前提。温度是影响微藻生长和代谢产物积累的关键环境因子之一, 因而温度培养条件最佳点的选择是微藻资源评价以及微藻生物质生产高产和优质的关键。然而微藻最适温度培养条件选择是一项极其繁琐和耗时的工作, 需要在温度控制仪器中进行多次实验获得, 且实验次数的增加必然会增加实验误差, 降低实验结果的准确性。为减少实验次数, 缩短实验周期, 本研究以两株分离自海口近岸海域的小球藻(Chlorellaspp.)为材料, 采用黄金分割优选法对其最适生长温度进行优化, 以期提高微藻培养温度优化实验的效率。

黄金分割法优选法又称0.618优选法, 是一种较简单的优选方法, 首先由数学家华罗庚等在20世纪70年代初在酿酒等生产单位开始推广并大量应用。其基本思想是: 以区间的0.618处作为探测点, 通过取探测点和探测点上函数值的比较, 使包含极值点的搜索区间不断缩短至任意小[5]。本研究结果表明, 利用黄金优选法, 通过3～4个温度点实验即可找出小球藻的最佳生长温度范围, 是微藻培养条件优化的一种较简易、有效的方法。

1 材料与方法

1.1 温度优选实验设计

首先根据小球藻的生物学特性, 以15～40℃作为小球藻温度优选的试验范围。温度优选试验分为几次进行。第1次实验: 以15～40℃范围的0.618处, 即30.5℃作为第1个温度试验点, 将其对称点24.5℃作为第2个温度试验点, 比较小球藻在这两个温度点的生长状况, 去掉“劣”点温度一端部分。第2次实验: 取已试验点(“优”点)的对称点作为第3次试验点, 在第3次试验点处试验, 将其结果与第1次试验留下的“优”点处试验结果进行比较, 再去掉“劣”点, 留下“优”点。第3次实验: 确定在留下部分中该“优”点的对称点为第4次试验点, 实验结果与第2次实验的“优”点结果比较, 再去 “劣”留 “优”。如此, 每次实验可以去掉试验范围的38.2%, 经过多次试验, 逐步缩小试验范围, 直至取得满意的结果。

1.2 藻种与培养

实验藻种小球藻HNC11(Chlorellasp.HNC11)分离自海南大学丘海湖, 小球藻 HNC2(Chlorellasp.HNC2)分离自海口市白沙门公园。采用不加Si的f／2培养基[6], 单藻种静止培养。海水取自海口市白沙门海水浴场, 经过滤后高压灭菌。培养基pH8.1, 盐度35。

取指数生长期的藻种按1:5比例接种于5 L玻璃三角瓶中。摇匀后分装于250 mL三角瓶中, 每瓶200 mL藻液。每个处理(温度实验点)4次重复。所有实验处理培养光强为100 μmol/(m2·s), 光暗周期为12h:12 h, 起始细胞密度为3 × 106个/mL。

1.3 分析方法

1.3.1 生长分析

培养液中小球藻的细胞密度与其在500 nm处的光密度值线性相关[7]。用可见分光光度计(B722s上海棱光技术有限公司)测定小球藻活体藻液的A500值, 据公式(1)换算成细胞密度。

式中,y为每mL藻液细胞数;x为500 nm 处的光密度值。

据公式(2)计算指数生长期的小球藻在1～8 d的相对生长速率。

式中,K为相对生长速率;t1、t2为对应的培养时间;N1和N2分别为t1、t2时期的细胞密度;T为细胞的平均倍增时间。

1.3.2 统计分析

对4次平行试验结果, 用DPS数据处理系统进行统计分析[8], Duncan新复极差法检验各处理间差异。

2 结果与分析

2.1 小球藻HNC11(Chlorella sp.HNC11)温度优选实验

实验结果表明, 小球藻HNC11在15℃和40℃条件下均可生长。静止培养条件下, 相对生长速率分别为0.11 d-1和0.14 d-1, 细胞倍增时间分别为6.38 d和4.85 d。因而, 以15～40℃作为温度优选实验范围。15～40℃范围的黄金分割点为30.5℃, 其对称点为24.5℃, 因此, 首先以30.5℃和24.5℃作为第1次实验的第1个和第2个温度实验点(图1a), 比较小球藻在两个温度条件下的相对生长速率。结果表明, 小球藻HNC11在30.5℃条件下的相对生长速率显著高于在24.5℃条件下的相对生长速率(P＜0.05,表1)。因此, 30.5℃为“优”点, 24.5℃为“劣”点, 去掉“劣”点一端部分, 则留下部分的温度区间为24.5～40℃(图1b)。

以30.5℃在24.5～40℃区间的对称点34℃作为第3个温度实验点, 进行第2次试验(图1b), 比较小球藻HNC11在34℃与30.5℃条件下的相对生长速率。为减小不同批次实验中因藻种生长状态等非处理因素引起的实验误差, 在第2次实验中同时进行了34℃与30.5℃两个处理。结果表明, 34℃条件下小球藻HNC11的相对生长速率和平均倍增时间显著优于(P＜0.05)在30.5℃条件下的(表1), 因此34℃为这个实验区间的“优”点。去掉“劣点”30.5℃一端, 则可以确定第3次实验的温度区间为 30.5～40℃(图1c)。小球藻在第1和第2次实验中的3 0.5℃温度点条件下的相对生长速率无显著差异(P＞0.05, 表1)。

第3次实验(图1c): 第2次实验的“优”点“34℃”在30.5～40℃温度区间的对称点为36.5℃。因而, 以36.5℃为第4个实验点, 比较小球藻HNC11在34℃和36.5℃条件下的生长速率。结果表明, 小球藻HNC11在两个温度条件下的相对生长速率和平均倍增时间无显著差异(P＞0.05,表1)。因而可以确定其最适生长温度为34～36.5℃。第2次和第3次实验中34℃温度点的小球藻的相对生长速率无显著差异(P＞0.05, 表1)。

图1 黄金分割优选法的温度实验点 Fig. 1 Temperatures selected with golden section method

2.2 小球藻HNC2(Chlorella sp.HNC2)温度优选实验

静止培养条件下, 小球藻HNC2在15℃和40℃条件下的相对生长速率分别为0.16 d-1和0.14d-1, 细胞倍增时间分别为4.3 d和4.9 d。

第1次实验(图1a): 以15～40℃温度范围的黄金分割点30.5℃为第1个实验点, 以其对称点24.5℃为第2个实验点, 比较小球藻HNC2在这两个温度条件下的生长速率。结果表明, 小球藻HNC2在30.5℃下的相对生长速率显著高于(P＜0.05)在24.5℃下的相对生长速率(表1)。因此, 30.5℃为“优”点, 24.5℃为“劣”点, 去掉“劣”点一端部分, 则留下部分的温度区间为24.5～40℃(图1b)。

第2次实验(图1b): 以30.5℃在24.5～40℃区间的对称点34℃作为第3个温度实验点, 比较30.5℃与34℃条件下的相对生长率。结果表明, 34℃条件下, 小球藻HNC2的相对生长速率显著低于(P＜0.05) 30.5℃条件下的相对生长速率(表1), 34℃条件下与24.5℃条件下的相对生长速率无显著差异(P＞0.05)。因此, 30.5℃为“优”点, 34℃为“劣”点, 去掉“劣”点一端部分, 则留下部分的温度区间为24.5～34℃(图1d)。

第3次实验(图1d): 以30.5℃在24.5～34℃区间的对称点28℃作为第3个温度实验点, 进行第2次试验。结果表明, 30℃条件下, 小球藻HNC2的相对生长速率与28℃条件下的相对生长速率无显著差异(P＞0.05)。由此推断, 小球藻HNC2的最适生长温度为28～30.5℃。

表1 不同温度条件下小球藻HNC11和HNC2的相对生长速率和平均倍增时间 Tab. 1 Relative growth rate and average generation time of Chlorella sp. HNC11 and Chlorella.sp. HNC2 under different temperature conditions

3 讨论

我国著名数学家华罗庚先生从1964年起, 在全国推广优选法, 利用“0.618优选法”解决了生产实践中的许多问题[9]。在单因素优选问题中, 黄金分割优选法在选择配比方法、操作工艺及农业生产方面都起到了重要作用, 不仅减少了试验成本, 降低了消耗, 而且提高了质量和产量[10-12]。我们实验结果表明, 应用黄金分割优选法, 可以用较少的实验次数快速地找到小球藻的最适培养温度。

在温度优选实验中, 为减少误差, 每次实验同时做两个实验点, 如HNC11的30.5℃实验点在第1次和第2次实验中各做了1次。而我们的结果表明, 当藻种的接种密度、培养基和生态因子等培养条件一致时, 小球藻在不同批次的实验中, 同一温度下的相对生长速率无显著差异(P＞0.05)。因此在利用黄金优选法时, 在控制藻种的接种密度、培养基及生态因子等培养条件一致性的情况下, 每个温度点仅做一次实验即可, 试验数将比本次实验的实验数减少。如小球藻HNC11在第2次实验中, 只测定34℃条件下的相对生长率即可, 然后与第1次实验的“优”点(30.5℃)结果比较即可。因而, 将黄金分割优选法应用在微藻最适培养温度条件的选择上, 将显著地减少实验次数, 提高优化效率。

小球藻是绿藻门小球藻科中的一个重要属, 其环境适应强, 分布较广, 生长快, 易大量培养, 在特定条件下可积累大量油脂[13-14], 因而不但是重要的饵料藻, 也是生产蛋白、色素及制备生物柴油的良好藻种。筛选适应不同生长环境的藻种有利于微藻的开发和利用。温度优选法的实验结果表明, 在海口近岸海域分离的小球藻株喜温耐热, 适宜在热带和亚热带地区培养。

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