MCP－1和FN 在中耳胆脂瘤上皮中的表达和意义

高燕 杨一兵 丛林海 汤勇 张帆

中耳胆脂瘤是耳科常见疾病，目前公认是机体防御慢性炎症引起的一系列的免疫应答反应之一，主要表现为中耳腔内有大量高度增生的角化鳞状上皮以及对周围骨质的破坏，其中胆脂瘤上皮细胞的移行、高度增殖及骨质破坏是该病的重要特征。近年来不少研究显示［1，2］单核细胞趋化因子（monocyte chemotactic factor，MCP－1）和纤维连接蛋白（fibronectin，FN）在炎性细胞的趋化激活及角质形成细胞的迁徙中起着重要作用，但其与中耳胆脂瘤的相关性鲜见报道。本研究通过免疫组化MaxVisionTM法检测MCP－1和FN 在中耳胆脂瘤上皮及正常耳后皮肤组织中的表达，结合病例组术前CT和术中所见听小骨及周围骨质的破坏程度，探讨它们在胆脂瘤侵袭及上皮迁徙过程中的作用。

1 资料与方法

1.1 临床资料 中耳胆脂瘤上皮标本30例，为昆明医科大学第一附属医院2010年8月～2012年8月手术、经病理检查证实为中耳胆脂瘤的石蜡标本，临床诊断均为后天继发性胆脂瘤，其中，男17例，女13例；年龄12～64岁，平均39.33±17.68岁；左耳12例，右耳18 例；病程1～60 年，平均16.00±15.82年。胆脂瘤患者耳后皮肤标本20例，为行乳突根治术中所取耳后正常皮肤标本，其中，男14例，女6例；年龄13～56岁，平均35.05±12.80岁；左耳12例，右耳8 例；病程2～40 年，平均16.00±10.46年。非胆脂瘤患者耳后皮肤标本16例，为耳廓外伤患者行清创缝合术或外伤性鼓膜穿孔患者行耳后径路Ⅰ型鼓室成型术时所取耳后正常皮肤标本。

1.2 主要试剂 兔抗人MCP－1多克隆抗体与兔抗人Fibronectin多克隆抗体均购自武汉博士德公司，两种抗体的滴度均为1：100。即用型快速免疫组化MaxVisionTM检测试剂盒及DAB 显色试剂盒购自福州迈新公司。

1.3 免疫组化染色方法 标本经常规甲醛固定，石蜡包埋，常规切片，厚约4μm。采用免疫组化Max－VisionTM对实验标本染色，严格按照MaxVisionTM试剂盒说明书操作，步骤如下：切片常规脱蜡和水化后，枸橼酸溶液中高温高压修复抗原，经内源性过氧化物酶阻断剂孵育10 min。依次加入一抗（多抗MCP－1和FN）4 ℃过夜，滴加MaxVisionTM试剂37℃孵育20min，DAB显色后，复染、脱水、透明和封片，显微镜下观察结果。磷酸盐缓冲液代替一抗作为阴性对照。

1.4 免疫组化结果判定

1.4.1 阳性标准：MCP－1和FN 阳性细胞主要在胞浆、胞膜出现棕黄色颗粒沉着，部分在胆脂瘤组织的基质中。组织分层：胆脂瘤上皮和正常耳后皮肤上皮层分为基底层（basal layer）、棘层（spinous layer）、颗粒层（granular layer）和角质层（straum corneum）［3］。胆脂瘤上皮的外周部分是胆脂瘤基质，由一层厚薄不一的纤维组织与邻近的骨壁或组织相连［4］。

1.4.2 结果判断标准

①人工计数：在高倍镜下（×400 倍），每张切片随机选择5个不重叠视野进行阳性细胞计数，每个视野计数200个细胞，计算5个视野阳性细胞的平均百分数。根据显色范围分为阴性（－）：阳性细胞＜5%；弱阳性（＋）：阳性细胞占5%～25%；中度阳性（＋＋）：阳性细胞占26%～50%；强阳性（＋＋＋）：阳性细胞＞50%。

②灰度值测定：应用高清晰彩色病理图像免疫组化测量系统（HMIAS－2000）进行免疫组化图像分析，经标准灰度校正后，随机每张切片取3个阳性视野，测定胆脂瘤组织中MCP－1及FN 的平均灰度值，灰度值随阳性表达量的增多而减小。

③中耳胆脂瘤侵袭能力评定［5］：术前CT 及术中观察胆脂瘤病变范围及听小骨破坏程度，按胆脂瘤上皮侵袭程度分成4组：①无明显听小骨破坏者为（＋）；②破坏砧骨者为（＋＋）；③破坏锤骨和砧骨者为（＋＋＋）；④破坏乳突天盖和／或乙状窦骨板者为（＋＋＋＋）。

1.5 统计学方法 采用SPSS17.0软件对人工计数结果采用完全随机设计四格表χ2检验；对灰度值检测结果采用单样本方差分析。胆脂瘤的侵袭能力与MCP－1 和FN 表达蛋白的灰度值采用Spearman等级相关分析；最后采用Pearson直线相关分析判断MCP－1和FN 蛋白在胆脂瘤中的表达是否有相关性。

2 结果

2.1 MCP－1和FN 在中耳胆脂瘤、非胆脂瘤患者耳后正常皮肤及胆脂瘤患者耳后正常皮肤中的表达 非胆脂瘤患者耳后正常皮肤和胆脂瘤患者耳后正常皮肤中MCP－1阳性表达呈弱阳性，为淡黄色颗粒，阳性表达率分别为37.5%和35.0%（图1、2），两者阳性表达率比较差异无统计学意义（P ＞0.05）。中耳胆脂瘤上皮中MCP－1阳性表达位于上皮全层，以棘层表达密度较高，颗粒较粗，表达呈强阳性，为深棕色颗粒，阳性率为70%（图3），与两组耳后正常皮肤比较差异均有统计学意义（均为P＜0.05）。非胆脂瘤患者耳后正常皮肤和胆脂瘤患者耳后正常皮肤上皮层中，FN 阳性表达率分别为31.3%和30.0%（图4、5），两者阳性表达率比较差异无统计学意义（P＞0.05）。中耳胆脂瘤上皮中FN 阳性表达位于上皮全层（基底层、棘层、颗粒层细胞及基质），表达密度较高，颗粒较粗，表达呈强阳性，为深棕色颗粒，阳性率为76.7%（图6），与两组耳后正常皮肤相比差异均有统计学意义（均为P＜0.05）。

2.2 中耳胆脂瘤上皮中MCP－1和FN 阳性表达的灰度值与中耳胆脂瘤侵袭能力的关系 MCP－1和FN 在三种组织类型中阳性表达的灰度值比较见表1，MCP－1或FN 在胆脂瘤上皮组中的表达灰度值低于胆脂瘤患者和非胆脂瘤患者耳后正常皮肤组中的表达灰度值，差异均有统计学意义（P＜0.01），而胆脂瘤患者和非胆脂瘤患者耳后正常皮肤中MCP－1或FN 的表达灰度值差异无统计学意义（P＞0.05）。采用Spearman 等级相关分析显示胆脂瘤侵袭能力与MCP－1阳性表达灰度值有相关性（rmcp－1=－0.682，P＜0.01），与FN 表达亦有相关性（rfn=－0.531，P＜0.01）。

2.3 中耳胆脂瘤上皮中MCP－1和FN 表达的相关性 采用Pearson直线相关分析，MCP－1和FN之间无线性相关关系（tr=0.332，P＞0.05）。

图1 MCP－1在非胆脂瘤患者正常耳后皮肤中表达呈弱阳性（＋）（免疫组化×400）图2 MCP－1在胆脂瘤患者正常耳后皮肤中表达呈弱阳性（＋）（免疫组化×400）图3 MCP－1在胆脂瘤上皮中表达呈强阳性（＋＋＋）（免疫组化×400）图4 FN 在非胆脂瘤患者正常耳后皮肤中表达呈弱阳性（＋）（免疫组化×400）图5 FN 在胆脂瘤患者正常耳后皮肤中表达呈弱阳性（＋）（免疫组化×400）图6 FN 在胆脂瘤上皮中表达呈强阳性（＋＋＋）（免疫组化×400）

表1 不同组织中MCP－1和FN 表达灰度值的比较（±s）

表1 不同组织中MCP－1和FN 表达灰度值的比较（±s）

组织类型例数MCP－1 平均灰度值 F P FN 平均灰度值 F P 30 147.2±20.1 139.2±18.5胆脂瘤患者耳后正常皮肤20 200.8±18.4 60.5＜0.001 195.0±12.9 95.8＜0.001非胆脂瘤患者耳后正常皮肤胆脂瘤上皮16 193.3±15.5 191.6±13.5

3 讨论

胆脂瘤虽然不是真正的肿瘤，却有着类似肿瘤的生物学特性，具有进行性生长及侵袭破坏局部骨组织的能力，其危害主要取决于周围骨质的破坏程度，如果能够明确其破坏骨质的机制，将对胆脂瘤的治疗有重要意义。慢性中耳炎在胆脂瘤的发病机制中有一定作用，其引起骨质破坏与免疫反应密切相关［6］。MCP－1对单核细胞、嗜碱性粒细胞、CD4＋、CD8＋、T 淋巴细胞及NK 细胞具有趋化激活双重功能，使各种炎性细胞尤其是单核细胞向病变部位聚集，诱导这些细胞产生超氧阴离子和溶酶体酶，并产生IL－1、IL－6及肿瘤坏死因子－α（TNF－α）等炎性因子，而表皮生长因子（EGF）、脂多糖（LPS）、IL－1β、IL－4、TNF－α、γ干扰素（IFN－γ）等又能够诱导这些细胞产生MCP－1，形成恶性循环，从而引起组织损伤。FN 能促进角质形成细胞移动，还能促进单核巨噬细胞和成纤维细胞的迁徙，而单核巨噬细胞和成纤维细胞均能产生胶原酶，在骨质破坏中起到重要的作用。

本研究结果显示，MCP－1主要在中耳胆脂瘤上皮棘细胞层和颗粒层中表达，FN 主要在上皮基底层和基质中表达，MCP－1和FN 在胆脂瘤上皮组织中异常增高，与胆脂瘤患者及非胆脂瘤患者耳后正常皮肤相比，差异有统计学意义（P＜0.01），说明胆脂瘤上皮具有趋化炎性细胞和高度迁徙能力。MCP－1和FN 在胆脂瘤患者和非胆脂瘤患者耳后皮肤之间的阳性表达差异无统计学意义（P ＞0.05），说明胆脂瘤上皮的趋化炎性细胞和高度迁徙能力只在胆脂瘤中体现，而在其他部位与正常人无异，与Helgaland等［7］、Schilling等［8］和Chao等［9］的研究结果相似；胆脂瘤的侵袭能力与MCP－1和FN 阳性蛋白的灰度值之间呈负相关（P＜0.01），而灰度值越低，阳性表达越高，说明胆脂瘤上皮的侵袭能力与MCP－1和FN 阳性表达呈正相关，MCP－1和FN 表达越强，胆脂瘤上皮的侵袭能力越强，胆脂瘤上皮中MCP－1和FN 的表达水平可能可以作为评估胆脂瘤上皮侵袭能力的指标，但MCP－1和FN 阳性表达之间并不存在线性相关关系。

MCP－1和FN 在中耳胆脂瘤上皮和基质中的异常表达可能在胆脂瘤的发生发展过程中起重要作用，炎性细胞浸润、胆脂瘤上皮高迁徙能力可能参与了中耳胆脂瘤角化复层鳞状上皮侵袭的机制。目前手术切除是治疗中耳胆脂瘤唯一有效治疗方法，但存在一定的复发率及并发症，且术后部分患者的听力无法恢复，能否以MCP－1和FN 为靶点研究局部用药，以延缓或阻止胆脂瘤上皮的侵袭能力，或者使胆脂瘤的角化复层鳞状上皮转变成非角化复层鳞状上皮及其他类型的上皮，从而阻止胆脂瘤的生长，可能是将来研究的方向之一。

1 Hamill KJ，Hopkinson SB，Hoover P，et al.Fibronectin expression determines skin cell motile behavior［J］.J Invest Dermatol，2012，132：448.

2 Voss A，Bode G，Kerkhoff C.Double－stranded RNA induces IL－8and MCP－1gene expression via TLR3in HaCaT－keratinocytes［J］.Inflamm Allergy Drug Targets，2012，11：397.

3 Svane－Knudsen V，Rasmussen G，Ottosen PD.The distribution of free calcium ions in the cholesteatoma epithelium［J］.Eur Arch Otorhinolaryngol，2005，262：77.

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5 江超武，展鸿谋，王文惠，等.转化生长因子β1和即刻早期基因及p27在中耳胆脂瘤上皮中表达［J］.中华耳鼻咽喉科杂志，2004，39：211.

6 夏明，丁寿玲，张寒冰，等.破骨细胞分化因子及其相关因子在中耳胆脂瘤组织中的表达［J］.临床耳鼻咽喉头颈外科杂志，2007，21：315.

7 Helgaland T，Engelen B，Olsnes C.In vitro cholesteatoma growth and secretion of cytokines［J］.Acta Oto－Laryngologica，2010，130：815.

8 Schilling V，Holly A，Bujia J.High levels of fibronectin in the stroma of aural cholesteatoma［J］.American Journal of Otolaryngology，1995，16：232.

9 Chao WY，Yuan QG，Huang CC.Localization of fibronectin in human middle ear cholesteatoma［J］.Arch Otorhinolaryngol，1988，245：160.