注射用赖氨匹林细菌内毒素检查法的研究*

凌 真

(扬州市药品检验所，扬州 225009)

赖氨匹林(lysine acetylsalicylate)是阿司匹林与赖氨酸的复盐，作为阿司匹林的衍生物，是由法国Egic制药公司于上世纪70 年代首推上市的一种新型解热镇痛药;其水溶性好，pH 值为5 ～6，适用于肌肉和静脉给药，起效快，有更强的镇痛解热作用。该药对造血机制、肝肾功能均无影响，同时含有人体必需的赖氨酸，临床用于小儿解热镇痛及癌症患者二、三级止痛，效果良好，应用广泛。

注射用赖氨匹林在现行的检验标准中，安全性检查的项目各有不同，分为家兔法和细菌内毒素检查法，其中细菌内毒素检查法的限值也不尽相同。从动物福利的角度出发，本文对注射用赖氨匹林的细菌内毒素检查法进行了研究，为更好地评价该药的质量提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 DC 3A 型干式恒温器(南京三爱斯技术开发有限公司);SW-CJ-1A 标准型洁净工件台;ZH-2型自动旋涡混合器(天津药典标准仪器厂);微量移液器(Gilson 法国)。试验所用玻璃器皿均250 ℃干烤30 min 以上，用以除去细菌内毒素。

1.2 材料 鲎试剂(灵敏度:0.25 Eu/ml，湛江安度斯生物有限公司，批号1206202);鲎试剂(灵敏度:0.25 Eu/ml，福州新北生化工业有限公司，批号12110112);细菌内毒素工作标准品(160 Eu/支，中国药品生物制品检定研究院，批号150601 -201174);细菌内毒素检查用水(5 m1，福州新北生化工业有限公司，批号11010405);注射用赖氨匹林(0.9 g/支，扬州一洋制药有限公司，批号120528、120415、120410)

2 方法与结果

2.1 鲎试剂灵敏度复核试验 按照《中国药典》2010年版二部附录XI E 细菌内毒素检查法［1］规定，对两个厂家的鲎试剂进行灵敏度复核，结果见表1。

依据公式λc=Antilg(ΣX/4)，两批鲎试剂的λc 均在0.5 ～2.0 λ (包括0.5 λ 和2.0 λ)，所以两批鲎试剂均可用于细菌内毒素检查。

2.2 L 的确定［2］成人体重为60 kg，临床使用剂量为1.8 g/d，M=30 mg/kg·h-1，L=K/M，根据《中国药典》2010 年版附录细菌内毒素检查法要求，K = 5 Eu/kg·h-1，则成人的L =0.167 Eu/mg，根据热原检查法，配制药液浓度为60 mg/ml，注射剂量为1 ml/kg，则L=K/(60 mg/ml·1 ml/kg)=0.0833 Eu/mg。因为临床使用，安全要求更高，选取L=0.08 Eu/mg。

2.3 MVC 的计算 MVC=λ/L，其中L 为注射用赖氨匹林的细菌内毒素限值0.08 Eu/mg，λ 为鲎试剂的灵敏度。目前市售鲎试剂灵敏度λ 通常为0. 5、0. 25、0.125、0.06 和0.03 Eu/ml，实验时，再向前增设一个浓度，则注射用赖氨匹林的对应最小有效稀释浓度分别为:12.5、6.25、3.12、1.56、0.78 和0.39 mg/ml。

表1 鲎试剂灵敏度复核

2.4 预试验 供试品(NPC)系列:用细菌内毒素检查用水将注射用赖氨匹林稀释成12. 5、6. 25、3. 12、1.56、0.78 和0.39 mg/ml 系列浓度，制成系列浓度溶液记为NPC。供试品阳性对照(PPC)系列:将供试品稀释成上述相同的系列浓度，在每一浓度供试品中都加入细菌内毒素标准溶液，使每一浓度供试品中均含有2 λ 浓度的内毒素，记此系列浓度为PPC。取灵敏度为0.25 Eu/ml 的两个厂家的鲎试剂，分别与上述NPC 系列和PPC 系列进行反应，每一浓度重复2 管，并设阳性(PC)和阴性(NC)对照各1 管，结果见表2。根据预试验结果可初步确定该样品在稀释至3. 12 mg/ml 及以下浓度时，对不同厂家的鲎试剂不产生干扰。

表2 注射用赖氨匹林干扰试验预试验

2.5 正式干扰试验 供试品干扰试验:用细菌内毒素检查用水将3 批样品稀释至3.12 mg/ml 作为供试品溶液，再用上述溶液及细菌内毒素检查用水将细菌内毒素工作品配制成0.5、0.25、0.125 和0.06 Eu/ml 浓度的系列内毒素溶液。每一内毒素浓度平行做4 管，并分别做2 管阴性对照，结果见表3。结果表明，Es 均在0.5 ～2.0 λ(包括0.5 λ 和2.0 λ)范围内，Et 亦均在0.5 ～2.0 Es(包括0.5 Es 和2.0 Es)，确认供试品在稀释至3.12 mg/ml 浓度后，对不同厂家生产的鲎试剂无干扰。

2.6 供试品细菌内毒素检查与热原检查结果比较按《中国药典》2010 年版二部附录ⅪE 中细菌内毒素检查法，用细菌内毒素检查用水将10 批注射用赖氨匹林稀释至3.12 mg/ml 浓度时，用两个厂家的鲎试剂(λ=0.25 Eu/ml)进行检查，结果全部呈阴性，与热原检查结果一致。

表3 注射用赖氨匹林正式干扰试验结果

3 讨论

3.1 预试验的目的是评价样品浓度对鲎试剂与内毒素凝集反应的干扰程度及干扰性质，以便筛选出对检查无干扰的样品浓度限值。从表2 和表3 可以看出，当样品稀释浓度高于3.12 mg/ml 时，用0.25 Eu/ml 的鲎试剂进行检测，PPC 系列样品不发生凝固反应。说明样品浓度高于3.12 mg/ml 时，对细菌内毒素检查试验的结果有干扰作用，这可能和样品本身成分及辅料或杂质成分有关，其成因有待进一步研究。

3.2 不同厂家生产的鲎试剂，其实际灵敏度与标示灵敏度略有差异，正式干扰试验采用两个厂家的鲎试剂与稀释至3.12 mg/ml 的供试液作用，结果Es 在0.5 ～2.0 λ(包括0.5 λ 和2.0 λ )，且Et 在0.5 ～2.0 Es(包括0.5 Es 和2.0 Es)之间，按照《中国药典》2010 版附录中干扰试验的判断方法，确认供试品在该浓度下无干扰作用。

3.3 鲎试剂法与家兔热原法相比，操作简便，灵敏度高，符合动物福利的要求，可以用细菌内毒素检查法代替注射用赖氨匹林的兔热原检查法。

注射用赖氨匹林是国家基本药物，临床使用良好，控制药品质量非常必要。对于安全性评价的热原法，具有检验成本高，个体差异大等不利因素，可以考虑用细菌内毒素检查法代替热原法，便于对产品质量进行评价。

1 中国药典［S］.二部.2010:附录99 -102

2 冯建新.注射用赖氨匹林细菌内毒素的检测［J］.中国医院药学杂志，2000，20(4):252