肝细胞核因子4α 在实验性结肠炎中的表达及意义

张剑美， 王 娟， 宋春艳， 袁宗丽， 陈岳祥

(第二军医大学长征医院消化内科，上海200003)

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种肠道非特异性炎症反应，其病因尚不明确，发病机制复杂，与环境因素、遗传易感性、感染因素、免疫反应等均有密切关系，尤其是肠道黏膜屏障功能及黏膜免疫应答在UC 的发生、发展、变化、转归过程中发挥着重要作用［1］。其病情迁延反复，难以有效控制，目前仍缺乏有效的治疗药物。

肠道黏膜为肠腔天然屏障，主要由肠上皮细胞组成，阻止病原菌或有毒大分子物质侵入黏膜，有效隔离体内外环境。其选择通透性功能保证了机体所需营养物质选择性吸收和转运，有效维持内环境稳定。近年研究发现肝细胞核因子4α(hepatocyte nuclear factor 4α，HNF4α)在维持肠道屏障结构及功能方面发挥重要作［2］。HNF4α 为配体激活核转录因子，属于核受体超家族成员，是HNFs 家族中HNF4蛋白一种亚型，以同源二聚体形式存在，通过与顺式作用元件结合，使染色体解聚，激活靶基因表达［3］。HNF4α 可通过乙酰化、甲基化、磷酸化以及与Smad3或Smad4 结合调节其自身活性，从而发挥多种生物学功能。HNF4α 在肠道组织中主要表达于肠上皮细胞，调控肠上皮细胞的增殖、分化、凋亡，维持肠道黏膜的稳态［4］。

本实验旨在通过观察HNF4α 在不同浓度DSS诱导的小鼠实验性结肠炎肠黏膜中的表达情况，探讨其与肠道黏膜屏障中重要连接蛋白:内皮型钙黏蛋白(E-cadherin，E-CAD)、连接黏附分子1(junctional adhesion molecule 1，JAM-1)、桥粒糖蛋白2(desmocollin 2，DSC-2)的关系，明确其在结肠炎发生、发展中的作用。

材 料 和 方 法

1 动物

BALB/c 小鼠22 只，SPF 级，雄性，6 周龄，体重20 ～22 g ，由上海斯莱克实验动物中心提供。

2 试剂

DSS 分子量36 ～50 kD，购自MP 生物医学公司;HE 染色试剂，解放军第411 医院病理科提供;小鼠抗人HNF4αⅠ抗(人鼠通用)，购自R＆D;HRP 标记抗鼠/兔通用型免疫组化检测Ⅱ抗和DAB 显色试剂盒购自Dako;Trizol、逆转录试剂盒、SYBR Green PCR试剂盒购自TaKaRa 公司。

3 方法

3.1 分组及造模 小鼠称重、编号，随机分为3 组:正常对照组(n =6)、2%DSS 组(n =6)和2.5%DSS组(预实验中2.5%DSS 诱导后可出现个体死亡，故增加该组样本数，n =10)。清洁级动物房饲养1 周后，分别给小鼠自由饮用普通饮用水(对照组)和分别含有2%、2.5%DSS 的饮用水，连续6 d，建立小鼠急性结肠炎模型。造模结束后，颈椎脱臼法处死所有小鼠，采集末端结肠标本备用。

3.2 小鼠一般情况观察及疾病活动指数评分 造模过程中，每天观察各组小鼠的体重变化、大便性状、便血情况并进行疾病活动指数(disease activity index，DAI)评分［5］。体重变化:无下降，0 分;下降1% ～5%，1 分;下降5% ～10%，2 分;下降10% ～15%，3 分;下降＞15%，4 分。大便性状:正常，0 分;松散，2 分;稀便，4 分。便血程度:正常，0 分;少量便血，2 分;重度血便，4 分。DAI =体重下降+大便性状+便血程度。

3.3 结肠组织学损伤评分 取结肠组织石蜡切片常规脱蜡至水，苏木素液染核，盐酸酒精分化，氨水返蓝，伊红染色数秒，逐级脱水、透明、中性树胶封片。染色结果:细胞核呈蓝黑色，细胞质呈淡红色。组织损伤学评分如下［6］:炎症严重程度:无，0 分;轻度，1 分;中度，2 分;重度，3 分。病变深度:无，0 分;黏膜下层，1 分;肌层，2 分;浆膜层，3 分。隐窝破坏:无，0 分;基底1/3 被破坏，1 分;基底2/3 被破坏，2分;仅有完整表面上皮，3 分;全部隐窝和上皮被破坏，4 分。病变范围:1% ～25%，1 分;26% ～50%，2分;51% ～75%，3 分;76% ～100%，4 分。组织学损伤评分=炎症严重程度+病变深度+隐窝破坏+病变范围。

3.4 免疫组织化学染色 取结肠组织石蜡切片常规脱蜡至水，碱修复液热修复抗原，山羊血清封闭，HNF4αⅠ抗(1∶200 稀释)4 ℃过夜，次日滴加标记有HRP 的抗鼠/兔通用型Ⅱ抗室温孵育，DAB(1∶70 稀释)室温显色，镜下控制反应时间。苏木素轻度复染，逐级脱水、透明、中性树胶封片。染色结果判定:HNF4α 蛋白定位于细胞核，呈棕黄色颗粒。根据阳性染色范围，将免疫组化切片用专业图像分析软件Image-Pro Plus 6.0 进行半定量分析，每张切片扫4个视野，用图像分析系统测量阳性染色面积并自动计算其与总面积的百分比。

3.5 实时荧光定量逆转录聚合酶链反应( real-time RT-PCR) Trizol 法提取结肠组织RNA，-80 ℃冰箱保存。取1 μg RNA 按说明书进行逆转录反应合成cDNA，用于PCR 扩增。PCR 引物采用Primer Premier 5 设计，由上海英潍捷基公司合成，引物序列见表1。Real-time RT-PCR 反应条件为:95 ℃预变性30 s，之后95 ℃5 s，60 ℃34 s，40 个循环后进行溶解曲线检测。数据处理采用2-ΔΔCt法。

表1 目的基因引物序列Table 1. The sequences of the primers for target genes

4 统计学处理

采用SPSS 18.0 统计软件，数据以均数±标准差(mean±SD)表示，Kolmogorov-Smirnov 方法进行正态性检验，Levene 方法进行方差齐性检验，多样本均数间的比较符合方差齐性采用LSD-t 检验，方差不齐采用Kruskal-Wallis H 检验，双变量相关性分析符合正态分布采用Pearson 方法，不符合正态分布则采用Spearman 方法。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 小鼠一般情况及DAI 评分

DSS 处理组小鼠造模后出现不同程度的体重下降、腹泻、便血，毛发无光泽，饮食明显减少，懒动等。正常对照组小鼠大便正常，体重增加，毛发有光泽，反应灵敏，活动正常。与对照组(0.00 ±0.00)相比，造模第6 天2%DSS 组DAI(5.00 ±1.79)明显增高(P ＜0.01)，2.5%DSS 组(9.90 ±1.52)升高更显著(P ＜0.01)。

2 小鼠结肠黏膜损伤及炎症细胞因子表达情况

光镜下，DSS 处理组小鼠结肠黏膜结构出现不同程度损伤，可见广泛的黏膜糜烂、出血、大面积深层溃疡，呈明显的急性炎症反应，上皮细胞脱落，大部分腺体被破坏，腺管排列紊乱，黏膜及黏膜下层大量炎性细胞浸润，黏膜下层新生小血管形成，有的区域腺体完全丧失，炎细胞浸润全层，见图1。2%DSS组小鼠结肠组织学评分(7.00 ± 0.90)较对照组(0.00 ±0.00)明显升高(P ＜0.01)，2.5%DSS 组评分(11.70 ±0.90)升高更显著(P ＜0.01)。正常组小鼠肠黏膜中肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα，TNF-α)和白细胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)mRNA 表达水平较低，经过DSS 诱导6 d 肠黏膜中炎症因子TNF-α 和IL-1β mRNA 出现不同程度升高，2.5%DSS 组升高更明显(P ＜0.05)，见图2。'

Figure 1. HE staining of mouse colon tissues. A1 and A2:control;B1 and B2:2%DSS;C1 and C2:2.5%DSS.图1 小鼠结肠组织HE 染色

Figure 2. Relative mRNA expression of TNF-α and IL-1β in colontissues. Mean±SD. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control.图2 小鼠结肠组织中TNF-α 和IL-1β mRNA 的表达

3 小鼠肠黏膜HNF4α mRNA 及蛋白表达变化

正常组小鼠肠上皮细胞中HNF4α mRNA(1.00±0.19)及蛋白表达(1.00 ±0.15)水平均较高，免疫组化染色显示HNF4α 主要定位在细胞核，呈棕黄色颗粒，见图3。经DSS 诱导6 d 2% DSS 组小鼠HNF4α mRNA(0.29 ±0.08)及蛋白表达量(0.27 ±0.12)较正常组明显减少(P ＜0. 01)，2. 5% DSS组HNF4α mRNA(0.10 ±0.11)及蛋白水平(0.11 ±0.07)下降更显著(P ＜0.01)。

4 HNF4α 蛋白表达水平与疾病严重程度的相关性

采用Pearson 方法分析小鼠肠黏膜中HNF4α 蛋白表达水平与DAI 及结肠损伤组织学评分的相关性，结果显示随着HNF4α 蛋白表达水平降低，DAI及组织学评分增高，相关系数r 分别为-0.88 和-0.93，呈显著负相关(P ＜0.01)。

Figure 3. Protein expression of HNF4α in colon tissues (upper panels，immunohistochemistry staining with HNF4α;lower panels，immunohistochemistry staining with HNF4α and nucleus). A1 and A2:control;B1 and B2:2%DSS;C1 and C2:2.5%DSS.图3 小鼠结肠组织中HNF4α 蛋白的表达

5 HNF4α mRNA 表达水平与细胞间连接蛋白的相关性

正常组小鼠肠黏膜中E-CAD、JAM-1 和DSC-2 mRNA 表达水平较高。2%DSS 组小鼠肠黏膜中ECAD、JAM-1 和DSC-2 出现不同程度减少，2.5%DSS组下降更明显(P ＜0.01)。对HNF4α 与上述连接蛋白mRNA 进行Pearson 相关性分析，发现随着HNF4α 表达减少，E-CAD、JAM-1 和DSC-2 表达均有下降，相关系数分别为0.96、0.73 和0.59，呈明显正相关(P ＜0.01)。

讨 论

DSS 诱导动物实验性结肠炎是当今研究溃疡性结肠炎的经典模型之一，其症状和肠道改变与人类UC 相似［7］。本研究中模型组小鼠DAI 升高，组织病理学损伤加重，炎症因子(TNF-α 和IL-1β)表达显著上升，细胞间连接蛋白(E-CAD、JAM-1 和DSC-2)表达则明显下调。E-CAD、JAM-1 和DSC-2 分别为紧密连接、黏附连接和桥粒的重要成员，参与维持肠道天然屏障结构及功能，在封闭细胞旁间隙中具有重要作用［8］。研究认为细胞间连接若被破坏，肠道通透性增加，更易诱发结肠炎［9］。所以寻找可调控炎症因子或连接蛋白的上游基因成为研究焦点。

近年研究发现HNF4α 是重要的肠道屏障功能基因，在UC 发生发展中发挥重要作用。肠上皮细胞中HNF4α 基因表达缺陷可导致细胞形态异常，细胞间连接松散［10］。胎鼠结肠缺乏HNF4α 基因则无法形成正常结肠结构，成年小鼠结肠缺乏HNF4α 基因则会导致肠上皮细胞分化受阻，细胞间隙增宽，数月后可出现自发性结肠炎，经DSS 诱导则可在数日内诱发急性结肠炎［11-13］。本研究中模型组小鼠肠道中HNF4α 表达明显下降，作为重要的肠道功能蛋白，HNF4α 对疾病严重程度是否有影响?我们采用Pearson 方法进行相关性分析，结果提示随着HNF4α表达降低，炎症程度、病变范围均有加重，两者间呈明显负相关。

为了进一步明确HNF4α 通过何种机制来影响炎症严重程度，我们分析了HNF4α 与连接蛋白、炎症因子之间的关系，结果表明HNF4α 与屏障连接蛋白E-CAD、JAM-1、DSC-2 表达水平呈明显正相关，但与炎症因子间相关性无统计学差异。这与Battle等［10］沉默肝细胞中HNF4α 基因表达导致多种连接蛋白表达缺失(如黏附连接中的E-CAD、紧密连接中的JAM-1、桥粒连接中的DSC-2 等)的结果相仿。故我们认为HNF4α 下调可导致细胞间连接蛋白减少，进而损伤肠道黏膜屏障，削弱肠道自我防护能力，这可能是UC 发病机制之一。然而本研究局限于初步分析，HNF4α 对E-CAD、JAM-1 和DSC-2 的具体调控机制仍有待进一步研究证实，也将是我们下一步研究重点。

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