黄芩苷提取精制工艺研究

廖矛川，罗会畏，李 竣，高瑞希，邹大江，黄先菊

(中南民族大学药学院，武汉 430074)

黄芩为唇形科植物ScutellariabaicalensisGeorg的干燥根[1]，其性寒味苦，具有清热燥湿，泻火解毒功效，主要产于我国东北、河北、山西、河南、陕西、内蒙古等地.其成分黄芩苷具有抑菌抗炎、清热解毒、螯合金属离子、镇静、降压、保护神经、抗变态反应和清除超声阴离子等药理作用[2]，是黄芩的主要活性成分之一，也是黄芩和黄芪制剂的主要质量控制指标成分.

黄芩中黄芩苷的提取工艺，除传统水提取酸沉淀法外，还有以醇和三正辛基氧化膦、碱水、磷酸三丁酯等可回收的有机溶剂为提取溶剂[3-5]的优势提取工艺.常用的精制方法有沉淀分离、高速逆流分离、大孔树脂分离[6,7]等.本文采用水提法、醇提法、碱水提法，并统一比较树脂法和酸沉淀法这2种工业可选用精制黄芩苷方法，确定黄芩中黄芩苷提取和精制的最佳工艺路线.

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黄芩饮片(广州南北行中药饮片有限公司，产地黑龙江，经中山大学张华林博士鉴定为正品黄芩)，D101型大孔树脂(安徽三星树脂科技有限公司)，黄芩苷对照品(110715-201016，中国药品生物制品检定所)，甲醇(色谱纯，美国TEDIA天地试剂公司)，其他试剂均为分析纯.

高效液相色谱仪(Agilent 1200series)，电子天平(CP214型，奥豪斯仪器有限公司)，低速离心机(TDZ5型，长沙平凡有限公司)，真空干燥箱(DZF-6050型，上海精宏有限公司).

1.2 黄芩提取溶剂的比较

称取50g的黄芩饮片，分别用水、60％乙醇、NaOH碱水(pH=10)回流提取3次，提取时间分别为2，2，1.5 h，每次提取溶剂量为12倍药材量(g / mL).提取后用2层纱布过滤，2500 r/min离心，取上清液干燥得粗提粉末.3种溶剂提取平行试验3次，按下式计算出膏率和黄芩苷得率.

出膏率=干浸膏重量/提取用生药重量×100％ ，

黄芩苷得率=黄芩苷重量/提取用生药重量×100％ .

1.3 黄芩苷精制的比较

1.3.1 酸沉精制实验

分别精密称取2.1中3种提取物干燥粉末各5.0 g，加入150mL蒸馏水40℃超声溶解，用稀HCl调至pH=2.0，80℃下保温30 min，静置过夜，以2500 r/min离心沉淀，洗涤沉淀至pH=7.0，真空干燥沉淀.

1.3.2 大孔树脂精制实验

称取90g D101型大孔树脂，无水乙醇湿法装柱，无水乙醇流动清洗，检查乙醇流出液至乙醇液与水(1∶5)混合不呈白色浑浊为止，以大量蒸馏水洗脱至无醇味，待用.分别精密称取2.1中3种提取物约3.0 g，以20mL水溶解，湿法上柱，使原液吸附30min，大量水淋洗，至洗脱液无色且薄层色谱检测不出糖类成分，再以75％乙醇洗脱至无色，收集洗脱液，真空干燥成粉末.

1.4 黄芩提取物黄芩苷含量测定

1.4.1 色谱条件

色谱柱：Syncronis C18(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇/0.4％磷酸(50∶50)；检测波长280nm；流速：1mL/min；柱温：30℃；进样量：20μL.理论塔板数以黄芩苷峰计算应不低于3000.在上述条件下，得黄芩苷的高效液相色谱图(见图1).

a)黄芩苷标准品；b)水提取物；c)碱水提取物；d)醇提取物；e～g)酸沉精制的水提取、碱水提取物、醇提取物；h～j)大孔树脂精制的水提取、碱水提取物、醇提取物

1.4.2 标准曲线的绘制

精密称定黄芩苷对照品10 mg，置于50mL容量瓶中，加50％甲醇溶解、定容、摇匀，制得200μg/mL黄芩苷对照品溶液.分别精密吸取对照品溶液0.25,0.50,1.00,2.00,4.00,8.00mL至10mL容量瓶中，以流动相稀释至刻度，摇匀，得浓度为5，10，20，40，80，160μg/mL标准溶液.分别吸取稀释后的标准溶液20μL进样，测定黄芩苷的峰面积.并以峰面积(A)对质量浓度ρ(μg/mL)，回归方程：A=58.121ρ-52.263，r=0.9992，表明黄芩苷在5～160μg/mL范围内线性良好.

1.4.3 样品含量的测定

精密称定不同方法下的黄芩样品各25mg，置于50mL容量瓶中，加入30mL 50％甲醇溶解.超声处理(功率250W，频率33kHz)30min，放冷，加50％甲醇定容至刻度，摇匀滤过，取滤液按下式计算黄芩苷含量:

黄芩苷含量(％)=[对应浓度(μg/mL)×20×100]/样品重(mg)×100％.

2 结果与分析

2.1 黄芩提取结果

黄芩经不同溶剂提取后，水提液为黄色浑浊液体，碱水为红色油状，醇提液为黄色澄清液体，结果见表1.由表1可知，碱水提取物中黄芩出膏率为(53.23±1.40)％，明显高于水和60％乙醇提取物(P<0.01)；60％乙醇提取物中黄芩苷得率为(11.84±1.14)％，高于水和碱水提取物(P<0.01)；3种提取方法中60％乙醇提取物中黄芩苷含量为(25.13±1.89)％，高于水和碱水提取物中黄芩苷含量(P<0.05).

表1 黄芩不同提取方法比较 (n=3)

**P<0.01；*P<0.05

2.2 酸沉精制结果

不同提取方法样品经酸沉淀精制后结果见表2.由表2可知，醇提取酸沉淀出膏率为(42.17±1.24)％，明显高于水和碱水提取物(P<0.01)；酸沉精制醇提物和水提取黄芩苷含量分别为(60.33±1.02)％和(69.29±1.54)％，明显优于碱水提取物(P<0.01)；醇提物黄芩苷得率为(25.40±1.02)％，高于水和碱水提取物(P<0.01).

表2 不同提取物酸沉法比较(n=3)

**P<0.01；*P<0.05

2.3 大孔树脂精制结果

不同提取方法样品经大孔树脂精制后结果见表3.由表3可知，大孔树脂精制后，黄芩出膏率醇提物和大孔水提物分别为(43.96±1.67)％和(34.90±1.52)％，明显优于碱水提物(P<0.01)；醇提物黄芩苷含量为(46.68±1.47)％，黄芩苷得率为(20.66±1.51)％，均高于水和碱水提取物(P<0.01).

表3 不同提取物大孔树脂精制比较(n=3)

**P<0.01；*P<0.05

2.4 各工艺路线比较分析

各工艺路线总黄芩苷得率和总出膏率的计算公式为：总黄芩苷得率=总出膏率×总黄芩苷含量，总出膏率为各种方法出膏率之积，总黄芩苷含量为精制所得黄芩苷含量；得出黄芩出膏率最高的方法是醇提取大孔树脂精制法为20.73％，黄芩苷得率最高的方法是醇提取酸沉淀法为11.93％，黄芩苷含量最高的方法是水提取酸沉淀法为69.29％.

3 讨论

黄芩苷为黄酮类化合物，脂溶性较大，在水中溶解度小，碱性条件下易溶解.根据其化学性质的特点采用了水、60％乙醇，碱水三种溶剂提取黄芩药材.结果显示碱水溶剂提取后黄芪出膏率明显高于水和60％乙醇的提取方法，但其所得杂质太多，长时间加热提取易破坏提取物的有效成分.D101型大孔树脂是一种球状、非极性聚合物吸附剂，常用于富集各种中草药中黄酮、皂苷等天然成分及复方，具有使用方便、价格低廉的优势，使用大孔树脂富集黄芩苷样品相比酸沉法损失量明显较小，故在不要求获得高纯度产品的条件下可以考虑使用大孔树脂富集黄芩苷.本实验采用大孔树脂精制醇提物，黄芩出膏率最高；酸沉淀法精制醇提取物，黄芩苷得率最高；酸沉淀法精制水提物，黄芩苷含量最高.故在实际应用中以大孔树脂精制醇提物和酸沉法精制水提物，能获得较高的黄芩出膏率和黄芩苷含量，为黄芩苷的开发利用提供基础.

[1]国家药典委员会.中国药典：I部[M].北京: 化学工业出版社,2010: 282-283.

[2]张建春,张 华,施 瑛,等.黄芩苷的研究近况[J].时珍国医国药,2005,16(3): 247-249.

[3]黎万寿,陈 幸.黄芩苷提取工艺研究[J].中草药,2000,31(2): 107.

[4] Kitazaki H,Ishimaru M,Inoue K.et a1.Separation of baicalein from baicalin by solvent extraction[J].Kagaku Kagaku Ronbun.1996,22(2): 287.

[5]Tsumura & Co.Method of separating and recovering flavone compound having glycoside structure and flavone compound not having glycoside structure: JP,WO/1996/002528 [P].1996-02-01.

[6] 刘彬果，钟 蕾，郭文勇,等.大孔吸附树脂法对黄芩总黄酮富集纯化工艺的研究[J].第二军医大学学报，2004,25(5): 562-564.

[7] Lu H T,Jiang Y,Chen F.Application of high-speed counter-current chromatography to the preparative separation and purification of baicalin from the Chinese medicinal plant Scutellaria baicalensis[J].J of Chromatogr A,2003,1017(1/2):117-123.