重组人细胞色素P450 2C9在毕赤酵母中的胞内表达

吴云华，孙鹏宇

(中南民族大学 生命科学学院，国家民委生物技术重点实验室，武汉 430074)

细胞色素P450(CYP450)酶系是一类血红蛋白超级家族，因其还原形态与CO结合后在450nm处有最大吸收波长而得名.CYP450依赖于氧气与NADPH催化内源性和外源性化合物，以氧化和过氧化发挥作用.CYP2C9是 P450酶第二亚家族中的一个重要成员，占肝微粒体P450蛋白总量的20％[1,2]，约16％的临床药物由CYP2C9代谢[3].

巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)表达系统为近年来发展起来的优良酵母表达系统，它是一类甲醇营养型酵母，在表达真核细胞外源蛋白时，不仅生长快、操作简便、成本低，还具备哺乳类动物细胞的翻译后加工和修饰的功能，适用于表达有生物活性的蛋白[4].细胞色素P450可在大肠杆菌中表达，但只有少数P450在毕赤酵母中成功表达[5- 9].本实验利用穿梭表达载体pPIC3.5k在毕赤酵母中表达P450，分析其作用性质，为研究细胞色素P450在毕赤酵母中的表达和催化能力奠定一定的基础.

1 材料和方法

1.1 材料和试剂

大肠杆菌DH5α、毕赤酵母GS115菌株和质粒pPIC3.5K由本实验室保存.DNA连接酶T4，限制性内切酶EcoR I、NotI，DNA聚合酶Pyrobest(TAKARA公司)，遗传霉素G418(Invitrogen公司)，抗His标签鼠单克隆抗体(康为世纪公司)，山羊抗鼠IgG二抗(Protein tech 公司)，超敏ECL化学发光底物试剂(博士德生物公司)，蜗牛酶、酸洗玻璃珠(Sigma公司).培养基(LB、YPD、MD、BMGY、BMMY)的配制均依照Invitrogen公司毕赤酵母操作手册.

1.2 重组菌株的构建和胞内表达

1.2.1 pPIC3.5K-2C9表达质粒载体的构建

P450 2C9片段用带有EcoR I位点，插入kozak真核表达加强序列的上游引物为CCGGAATTCGCCACCATGGCTCGACAATCTTCT，带有NotI位点并插入6×His标签的上游引物为ATAAGAATGCGGCCGCTCAGTGATGGTGATGGTGATGGACAGGAATGAAGCAC.PCR反应条件为：94℃预变性4 min，32个循环(94℃变性30 s，56.3℃退火30 s，72℃延伸2 min)，72℃延伸7 min.

PCR产物和pPIC3.5K表达载体用EcoR I和NotI双酶切，凝胶回收目的片段，T4连接酶16℃连接过夜.热激转化至大肠杆菌DH5α中，转化的菌液涂于氨苄青霉素LB平板，37℃培养过夜.挑取生长的单菌落为模板PCR扩增，提取含有目的片段的重组质粒DNA，将EcoR I和NotI双酶切验证成功的菌落送公司测序.

1.2.2重组转化子的筛选和PCR验证

按Invitrogen 毕赤酵母表达手册，用SalI对重组质粒 (pPIC3.5K-2C9)和空载体(pPIC3.5K )分别线性化，再用电击法转化毕赤酵母感受态细胞 GS115，并将转化菌体均匀涂布于MD固体培养基.SalI线性化质粒转化GS115后，多在HIS4位点上发生重组，转化子多为Mut+表型，由于质粒含有AOX1基因序列，可能在AOX1位点发生重组，破坏野生型AOX1基因，产生MutS转化子，故将HIS+转化子按顺序分别先后点种于MM和MD平板，比较其生长情况以检测Mut+转化子.

待MD 平板长出HIS+的转化子之后，加入 1～2 mL 无菌水重悬转化子，转移到50 mL无菌离心管剧烈震荡，打散细胞，分光光度计测定细胞浓度(1OD600= 5×107/mL)，稀释细胞悬液，按1×105/mL细胞涂布含不同G418浓度(0,2.0,4.0 mg/mL)的YPD 平板上，30℃培养，2～5d后筛选具有高G418抗性且生长良好的菌株.挑取检测后的HIS+转化子用蜗牛酶37℃处理菌体，SDS碱裂解法提取酵母基因组DNA进行PCR.用引物5′-AOX:5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′,3′AOX1:5′-AGGCAAATGGCATTCTGACATCC-3′来验证转化子，PCR反应条件为：预变性95℃ 5 min，30个循环(95℃变性1 min,55℃退火1 min,72℃延伸1.5 min),72℃延伸7 min.

1.2.3 P450 2C9毕赤酵母的胞内表达

经PCR验证的GS115-pPIC3.5K-2C9重组菌株和GS115-pPIC3.5K空载体菌株按照Invitrogen公司毕赤酵母操作手册在BMGY培养基中培养至OD600=2～6后转接到诱导培养基BMMY中.30℃，275 r/min培养，每24 h加入0.5％ (V/V)的甲醇并分别取24,48,72,96 h样品分析表达水平.

1.3 重组蛋白的定性检测

1.3.1 细胞裂解和SDS-PAGE

收集不同诱导时间菌体于室温2000×g离心15 min，重悬于buffer A(50 mmol/L磷酸钾缓冲液,PH 7.6,20％甘油,1mmol/L PMSF)至0.5g /mL，在液氮速冻后贮存于-80℃.细胞于冰上解冻后，2000×g 4℃离心10 min收集细胞，重悬于buffer B (50 mM磷酸钾缓冲液,PH 7.6,20％甘油,1 mmol/L PMSF,1mmol/L EDTA,10 mmol/L β-巯基乙醇)至0.5g湿菌体细胞/mL.

加入等量酸洗玻璃珠，涡旋1min，冰上放置1min，重复10次破碎酵母细胞.收集破碎后细胞混合物，取部分于14 000×g 4℃离心30 min，分别收集上清，并将沉淀重悬于buffer B[10].取细胞混合物、上清和沉淀于冷冻干燥机浓缩3 h，SDS-PAGE分析浓缩液.

1.3.2 Western blot分析

浓缩后细胞破碎样品的上清、混合液和沉淀与SDS-PAGE上样缓冲液混合后进行SDS-PAGE电泳分离.蛋白样品电转至硝酸纤维素膜上进行Western blot检测.膜浸于封闭液(5g/100 mL脱脂奶粉,10 mmol/L Tris-HCl,150 mmol/L NaCl,pH 8.0,0.05％ Tween-20)封闭2 h.加入抗His标签鼠单克隆抗体(稀释5000倍)4℃孵育过夜.加入过氧化物标记的山羊抗鼠IgG二抗(稀释5000倍)与一抗结合，杂交箱中孵育1 h.将膜置于保鲜膜上，混合0.5 mL超敏化学发光底物试剂 ECL 1与0.5 mL ECL 2，将混合后的工作液加至膜的蛋白质面，准确反应1min后，将膜置于另一保鲜膜上，于化学发光检测器中曝光不同的时间，记录化学发光图像.

2 结果

2.1 重组表达载体pPIC3.5K-2C9的载体构建

2.1.1 菌落PCR验证

挑取10个经氨苄青霉素筛选成功的单菌落直接PCR，结果如图1所示，有5个单菌落可扩增约1500 bp的CYP2C9目的片段，说明重组表达载体pPIC3.5K-2C9的载体构建成功.

M)5000bp DNA Marker；1～10)10个单菌落PCR扩增产物

2.1.2 重组质粒的双酶切鉴定

用EcoRI和NotI双酶切结果如图2所示，可见9000 bp的pPIC3.5K质粒和1500 bp的CYP2C9目的片段，进一步验证重组质粒构建成功.

M)15 000 bp DNA Marker；1～4)重组pPIC3.5K-2C9质粒

2.1.3 测序验证

鉴定正确的重组质粒送基因公司双向测序，结果表明目的片段插入位点和碱基序列正确，说明CYP2C9基因序列已成功地插入到载体pPIC3.5K的指定位点.

2.2 表达载体pPIC3.5K-2C9的电转化

2.2.1Mut+表型的筛选

如图3所示，分别点种于MM和MD平板的HIS+转化子在两种平板上生长情况没有明显区别，说明转化子没有发生MutS表型的突变.

1)MD平板上生长的转化子；2)MM平板上生长的转化子

2.2.2 高抗性重组菌株的筛选

高抗性重组菌株的筛选结果如图4所示，收集的转化子5 d后在2.0,4.0 mg/mL的YPD平板上生长.分别得到10个和2个生长较迅速的大菌落,估计是高拷贝整合菌株，分别用于后续的蛋白质的表达.

1)4.0mg/mL的YPD平板生长的转化子；2)2.0 mg/mL的YPD平板生长的转化子

2.2.3 重组菌株基因组的PCR验证

提取重组的基因组DNA，用AOX1引物和CYP2C9特异引物以基因组DNA为模板进行PCR扩增，结果见图5.由图5可见，用AOX1引物可扩增出约2200 bpAOX1基因和1700 bp(1500 bp目的基因序列+214 bp载体上序列)的目的片段；用CYP2C9特异引物可扩增出1500 bp的目的片段，验证了重组子中插入了目的序列并且插入方向正确.

M)5000bp DNA Marker；1～4)AOX1引物扩增基因组DNA；5～8)CYP2C9特异引物扩增基因组DNA

2.3 CYP2C9基因的诱导表达和鉴定

2.3.1 SDS-PAGE电泳检测CYP2C9

利用SDS-PAGE电泳检测CYP2C9结果见图6.如图6所示，在蛋白质相对分子质量标准为55KD处,CYP2C9重组酵母菌的表达细胞上清、混合液、沉淀较阴性对照有差异表达条带，但表达量较低，条带不十分明显.

M)蛋白质Marker；1)pPIC3.5K空载上清；2～5)分别为诱导24,48,72,96 h上清；6、9)pPIC 3.5K空载混合；7、8、10、11)分别为诱导24,48,72,96h混合；12)pPIC3.5K空载沉淀；13～16)分别为诱导24,48,72,96 h沉淀

2.3.3 重组蛋白的Western Blot检测

重组的CYP2C9蛋白的Western Blot检测结果见图7.如图7所示，在55KD处有单一条带出现，在上清、沉淀中都有检测到信号，而转化的pPIC3.5K空载体对照菌株未检测到信号，证明CYP2C9成功地在毕赤酵母中表达.

M)蛋白质Marker；1)pPIC3.5K空载上清；2～5)分别为诱导24,48,72,96 h上清；6、9)pPIC 3.5K空载混合；7、8、10、11)分别为诱导24,48,72,96 h混合；12)pPIC3.5K空载沉淀；13～16)分别为诱导24,48,72,96 h沉淀

3 讨论

本实验用人细胞色素P450 2C9成熟肽编码区在毕赤酵母中进行甲醇诱导表达，由 SDS-PAGE 和Western blotting 分析结果表明：人细胞色素P450 2C9 能在毕赤酵母中成功表达，但CYP2C9的表达量较低,SDS-PAGE未能检测到明显的目的蛋白质，推测CYP2C9并不十分适合毕赤酵母表达系统.据现有数据，在毕赤酵母中表达可测水平外源蛋白的概率约为75％.若想获得CYP2C9在毕赤酵母中的高水平表达，还需结合CYP2C9自身特点，如外源基因的结构特点，需符合酵母的偏好密码子[11]、不含易被蛋白水解酶作用的序列、AT含量不能过高、mRNA的非翻译区的长度和序列尽量与AOX基因一致[12]；培养条件的优化，包括通气量、诱导剂甲醇的浓度、培养温度[13]、培养时间、pH值等[14]，进一步分析研究.

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