5-Aza-dC对Molt-4细胞RASSF10基因启动子的去甲基化作用

汪 茗， 章 尧， 谢向荣， 刘善浩， 戚之琳， 毕富勇

(1.皖南医学院生化教研室， 芜湖 241002; 2.弋矶山医院心内科，芜湖 241001; 3.弋矶山医院血液内科， 芜湖 241002)

DNA甲基化异常作为一种表观遗传学现象，是细胞癌变过程中的早期、频发事件，并且是一个可逆的生物学过程。因此甲基化的特异基因可作为肿瘤早期诊断、治疗的分子标志，而对特异基因进行去甲基化处理则可以达到治疗肿瘤的目的[1-2]。RASSF10是最近鉴定出的RASSF家族的新成员[3]。已有报道提示RASSF10的启动子甲基化在甲状腺癌、前列腺癌[3-4]等肿瘤中频繁出现。本研究以人急性淋巴细胞白血病细胞株Molt-4细胞为研究对象，采用MTT、RT-PCR、Western blot、COBRA等方法研究甲基化抑制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-2′deoxycytidine，5-Aza-dC)对Molt-4细胞的增殖、RASSF10 mRNA、蛋白表达及RASSF10基因启动子甲基化状态的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 人急性淋巴细胞白血病细胞株Molt-4细胞购自中科院上海细胞生物研究所。

1.1.2 试剂 5-Aza-dC购自Sigma公司；RPMI1640培养基购自Hyclone公司；RNA提取、RT-PCR试剂盒购自TAKARA公司；基因组DNA提取试剂盒购自Qiagen公司；DNA甲基化试剂盒购自Millipore公司；DNA marker 及引物均购自上海生工公司；RASSF10多克隆抗体购自Abgent公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 采用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液，将Molt-4细胞置于37℃，5% CO2饱和湿度的孵箱中培养。倒置显微镜下观察细胞生长状况。

1.2.2 MTT(四唑盐比色法) 取对数生长期细胞，调整浓度为1×105/mL，接种于96孔板。5-Aza-dC作用24、48、72 h后取出培养板，每孔加入MTT(5 g/L)20 μL, 37℃继续培养4 h后，离心弃上清，加DMSO 150 μL,震荡后酶标仪570 nm下测定各孔的吸光度A，按下式计算细胞增殖抑制率。

细胞增殖抑制率(%)=(A对照-A实验)/A对照×100%

1.2.3 RT-PCR(逆转录-聚合酶链式反应) 5-Aza-dC作用72 h后，Trizol提取总RNA，紫外分光光度计检测RNA纯度(A260/A280>1.8)。两步法RT-PCR按试剂盒说明进行扩增。RASSF10上游引物:5′-GCGCCATGGATCCTTCGGAAAA-3′，下游引物: 5′-GGCAGCGCCTCGTCGTC GTCCT-3′，产物244 bp。GAPDH为内参，上游引物:5′-TGAAGGTCGGAGTCA ACGGATT TGGT-3′，下游引物：5′-CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC-3′，产物984 bp[4]。扩增条件：95℃预变性 3 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，共30个循环；72℃ 10 min，4℃维持。产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后，EB染色，捷达801凝胶成像分析系统对结果进行分析。用ARASSF10/AGAPDH表示RASSF10 mRNA相对水平。

1.2.4 Western blot(免疫印迹法) 收集5-Aza-dC处理72 h后Molt-4细胞的总蛋白，按100 μg/孔上样。10% SDS-PAGE电泳后转膜至NC膜上。5%脱脂牛奶封闭1 h，封Ⅰ抗RASSF10 (1∶500)4℃过夜。次日TBST、TBS洗膜。封HRP标记的羊抗兔Ⅱ抗(1∶2000)45 min，同法洗膜。ECL化学发光，将膜置于暗盒中，暗室内胶片曝光，冲洗胶片。

1.2.5 COBRA(亚硫酸氢钠联合限制性内切酶分析法) 取对照组及10 μmol/L 5-Aza-dC处理72 h后的Molt-4细胞，按DNA提取说明书提取各组细胞基因组DNA，并进行 DNA纯度测定：A260/A280>1.8。按DNA甲基化试剂盒说明书对DNA进行修饰及纯化，并取亚硫酸氢钠修饰的DNA 进行半巢式PCR扩增。扩增方法参考文献[4]。其外部引物RASSF10 COU1:5′-ATAAGTAGAGGAGTTAGTAGGTTAAAGGAGA-3′，RASSF10 COL1: 5′-CCCCCAAAACC CAAAACTATAACTAA A-3′；半巢式PCR内部引物为 RASSF10 COL2: 5′-A AATACAAA AAACTCAA AACCCAA ACCC-3′和 RASSF10 COU1[4]。取PCR 产物(241bp)用10 U TaqI进行消化，将产物进行2% 琼脂糖凝胶电泳。结果判断：样本出现消化的短链DNA条带者说明该基因启动子区存在甲基化，PCR后具有TaqI识别位点，可被TaqI识别并水解；样本未出现消化短链DNA条带者为基因启动子区不存在甲基化，PCR后没有TaqI识别位点，不能被水解；结果介于两者之间的为该基因启动子存在部分甲基化。

1.3 统计学处理 采用SPSS11.5进行统计分析，组间比较用单因素方差分析，组内比较用t检验，P<0.05有显著性差异。

2 结果

2.1 5-Aza-dC对Molt-4细胞增殖的影响 如图1所示，Molt-4细胞经3种不同浓度5-Aza-dC处理后，细胞增殖抑制率均高于对照组，差异有统计学差异(P< 0.01)，且不同浓度组之间的区别亦具有统计学意义(P<0.05)。结果提示，5-Aza-dC对Molt-4细胞增殖的抑制作用呈现时间、剂量依赖性。

2.2 5-Aza-dC对RASSF10 mRNA表达的影响 如图2所示，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳显示，RASSF10 mRNA在对照组Molt-4细胞中不表达，而经过2.5、5、10 μ mol/L的5-Aza-dC处理后可见RASSF10 mRNA恢复表达，RASSF10表达强度与5-Aza-dC的浓度呈剂量依赖关系。RASSF10相对表达量用ARASSF10/AGAPDH表示，结果如表1所示，差异有统计学意义(P<0.05)。

图1 5-Aza-dC对Molt-4细胞增殖的影响

图2 5-Aza-dC对Molt-4细胞RASSF10 mRNA 表达的影响

表1 5-Aza-dC对Molt-4细胞RASSF10 mRNA表达的影响

*—P<0.05, **—P<0.01vscontrol.

图3 5-Aza-dC对Molt-4细胞RASSF10蛋白表达的影响

表2 5-Aza-dC对Molt-4细胞RASSF10蛋白表达的影响

*—P<0.05, **—P<0.01vscontrol.

2.3 5-Aza-dC对RASSF10蛋白表达的影响 由图3，表2可见，对照组及5-Aza-dC各浓度组细胞的内参GAPDH表达量无显著区别，而对照组细胞无RASSF10表达，5-Aza-dC各处理组的RASSF10蛋白表达量显著上调，与5-Aza-dC浓度有关，差异有统计学意义(P< 0.05)。

2.4 5-Aza-dC对RASSF10基因启动子甲基化状态的影响 COBRA实验检测Molt-4细胞采用5-Aza-dC处理前后RASSF10基因启动子区域甲基化状态，结果如图4所示。对照组消化的DNA条带明显，说明对照组存在启动子甲基化现象，PCR扩增后含有TaqI识别位点，可被TaqI消化水解，出现水解条带。而经10 μmol/L 5-Aza-dC作用72 h后的处理组，可见清晰的未被TaqI消化水解的条带，消化水解的DNA条带不明显。说明启动子有甲基化和非甲基化共存的现象，原先甲基化的RASSF10基因启动子区域大部分被去甲基化了。

图4 5-Aza-dC对Molt-4细胞RASSF10基因启动子甲基化的影响

3 讨论

肿瘤基因启动子区域DNA甲基化是遗传外修饰调控的一种重要方式，它可引起基因表达沉默，从而下调抑癌基因表达，导致肿瘤的发生。近年来，越来越多的研究显示人类众多肿瘤的发生、发展与DNA甲基化的异常有关，基因启动子区CpG岛高甲基化可导致抑癌基因表达沉默进而导致肿瘤发生，这也是白血病发病的重要机制之一[2,5-6]。

Ras相关结构域家族(Ras-association domain family,RASSF)则是Ras激活信号转导通路中的一组负向调节基因，通过调控细胞周期和细胞凋亡而介导肿瘤抑制效应。RASSF至少包括10个成员：RASSF1-10。其中RASSF1-6属于“经典成员”，都含有C末端的RA(Ras-association)结构域和SARAH(Sav/RASSF/Hippo)结构域。而RASSF7-10的N末端都含有RA结构域但是缺乏SARAH结构域，因此被称为“N端RASSF家族”[7-8]。它们参与了很多关键的生物学过程，比如：细胞死亡、增殖、微观的稳定性、启动子的甲基化、对缺氧的反应等。RASSF10是“N端RASSF家族”的新成员，是新近被鉴定出的含一个单独的外显子基因，位于11 p15.2，含有一个大的CpG岛，覆盖了这个基因的大部分[7-10]。目前已有文献报道在人类众多肿瘤中发现RASSF的一些成员频繁失表达，且认为RASSF基因启动子的甲基化是其失表达的重要原因[7-13]。但有关RASSF10甲基化与白血病相关性的研究还比较少，关于急性白血病RASSF10启动子甲基化的研究尚处于初级阶段，本研究探讨了甲基化抑制剂5-Aza-dC在体外对白血病细胞株Molt-4细胞的增殖抑制作用及对RASSF10基因启动子甲基化的影响。

5-Aza-dC是常用的DNA甲基转移酶抑制剂，可通过抑制DNA甲基转移酶1(DNMT1)的甲基转移活性而发挥去甲基化作用。已有研究报道5-Aza-dC可使多种含有CpG岛的高甲基化抑癌基因重新表达，从而使抑癌基因恢复其抑癌的功能。以往研究发现，多个基因启动子区域甲基化而失活的抑癌基因被5-Aza-dC处理后可被重新激活，如RASSF1A基因[14]、p16基因[15]等。本研究采用5-Aza-dC处理急性淋巴细胞白血病细胞株Molt-4细胞，研究发现经过不同浓度5-Aza-dC处理后，Molt-4细胞增殖均受到了明显抑制，5-Aza-dC具有显著抑制白血病细胞增殖的作用。为进一步探讨5-Aza-dC抑制白血病细胞增殖的作用机制，本研究还继续观察了其对抑癌基因RASSF10基因启动子甲基化状态产生的影响。为减少因5-Aza-dC自身对细胞的毒性作用而对实验结果产生的影响，本研究选用的是3种较小的有效浓度来处理Molt-4细胞，结果显示在对照组Molt-4细胞中RASSF10基因启动子是被甲基化修饰的，RASSF10 mRNA、蛋白在Molt-4细胞中不表达，但经过10 μ mol/L 5-Aza-dC处理后，RASSF10基因启动子部分发生去甲基化作用，其RASSF10 mRNA、蛋白重新出现表达，证明了RASSF10基因启动子的高度甲基化修饰是导致抑癌基因RASSF10失表达的主要机制。5-Aza-dC可通过使抑癌基因RASS F10基因发生去甲基化作用，进而使RASSF10重新恢复表达而发挥抗白血病效应。

综上，本研究结果提示甲基化抑制剂5-Aza-dC能使急性淋巴细胞白血病Molt-4细胞RASSF10基因的甲基化程度降低，诱导其重新表达，从而抑制了Molt-4细胞的增殖。实验结果既为RASSF10作为白血病治疗新靶点的确认提供了理论依据，也为急性白血病的去甲基化治疗提供了理论基础。

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