PFOS对斑马鱼胚胎及仔鱼的生态毒理效应

夏继刚，牛翠娟 ，孙麓垠

(1.生物多样性与生态工程教育部重点实验室，北京师范大学生命科学学院，北京 100875;2.重庆师范大学进化生理与行为学实验室，重庆市动物生物学重点实验室，重庆 401331)

全氟辛烷磺酸(Perfluorooctane sulfonate，PFOS)是全氟类有机化合物(Perfluorinated compounds，PFCs)的代表物质之一。由于具有疏水、疏油、耐高温等特性，PFOS被广泛应用于纺织、皮革、地毯、防护涂料、表面活性剂、泡沫灭火剂、印染、金属电镀、食品包装等行业以及化妆品、农药和医药品等产品的生产中［1］。PFOS化学性质稳定，不易挥发，在环境中难降解，易在生物体内蓄积且具毒性，为著名的持久性生物累积毒性(PBT，Persistent－Bioaccumulative－Toxic)类污染物质［2－4］。2009 年 5 月，PFOS 作为一种新型持久性有机污染物(Persistent Organic Pollutants，POPs)被正式增列入《斯德哥尔摩公约》。如今，PFOS等POPs污染物已在全世界范围内的各类环境介质、生物体和人体内陆续被检出，对POPs生态毒理学效应的研究成为当前生态学与环境科学的前沿和热点问题之一［5－9］。

水生生态系统普遍存在着不同程度的PFOS污染，某些地区地表水PFOS浓度高达67μg/L，总的PFCs甚至高达17 mg/L［10］，我国长江、嘉陵江以及三峡库区江水均存在着不同程度的全氟化合物污染［11］，在长江野生鱼体内还普遍检测出了PFOS，长江武汉段鲤鱼(Cyprinus carpio)肝脏PFOS含量高达41.6μg/kg［12］。PFOS不但在自然水体中广泛存在，在自来水中也能检测到，广州、深圳自来水中的PFOS含量已分别达到10.3 ng/L 和 14.8 ng/L［13］。PFOS具有环境内分泌干扰作用［14－15］，可以导致斑马鱼(Danio rerio)肝脏卵黄蛋白原(vitellogenin，VTG)表达量显著升高［16］;PFOS暴露还可以损伤细胞膜，导致胚胎分裂中的细胞发生自溶［17］;致使细胞线粒体能量代谢障碍、抑制细胞间隙连接通讯［18］;引发免疫与神经毒性［19－20］等。PFOS 对仔鱼生态毒理效应的研究相对较少。

斑马鱼是一种小型热带淡水鱼，在生态毒理学研究与风险评价中，如今已被作为模式生物广泛用于各类生物学研究和各种化学品的毒性测试，是水体污染检测与评估的理想指示生物［21］。本文研究了PFOS暴露对斑马鱼胚胎及仔鱼的生态毒理效应，为评估PFOS的发育与行为毒性提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

性成熟斑马鱼购于北京中蔬大森林花鸟鱼市场，于实验室条件下驯养适应1个月，饲养方法参照Westerfield［22］。饲养及实验条件如下:实验用水为充分曝气脱氯并经过活性炭过滤的自来水，水温(24±1)℃，pH 值(7.6±0.6)，溶解氧＞4 mg/L，总硬度 220—250 mg/L，光暗周期 14 L ∶10 D，饲养密度 ρ＜ 1 g/L。每日投喂2次冰冻红虫(北京绿环观赏鱼用品公司)，投喂15 min后，吸去残饵。在实验前一晚，将雄鱼(0.41±0.003)g、雌鱼(0.49±0.004)g按雌雄比1∶1配对，过夜;次日光照开启2h后移出亲鱼，收集受精卵，清洗除去残余物，并暴露于不同浓度的PFOS溶液。

1.2 试剂

全氟辛烷磺酸(Perfluorooctane sulfonate，PFOS≥ 98%)购自(Sigma－Aldrich，Germany)。实验共设4个PFOS浓度梯度:对照(0)，0.1 mg/L，1 mg/L，10 mg/L。将 PFOS 以二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)为助溶剂，配置成0.5 g/mL的PFOS母液，4℃避光保存，待用。

1.3 暴露试验

挑选发育正常、大小相近的受精卵开展实验，将受精卵于受精后4h内(囊胚期)暴露于不同浓度的PFOS污染液中。胚胎暴露在24孔细胞培养板中进行，每孔放入3枚受精卵，并加入3 mL相应浓度的PFOS暴露液，每12h更换新配制的相同浓度的PFOS暴露液1次，对照组DMSO体积浓度为0.002%，染毒期间水温保持在(24±1)℃，光暗周期14 L ∶10 D。

以每孔处理为1个样本(n=48)，分别于受精后的第72小时(72 hpf，hour post－fertilization)、84小时(84 hpf)、96小时(96 hpf)、108小时(108 hpf)、120小时(120 hpf)、144小时(144 hpf)统计孵化率、孵出仔鱼畸形率(包括脊柱弯曲、心包囊肿、尾部畸形)及死亡率等;于受精后的第4天(4 dpf，day post－fertilization)、第8天(8 dpf)将斑马鱼仔鱼于0.02%MS－222(tricaine methanesulfonate)中麻醉，解剖镜下观察记录斑马鱼仔鱼心率;于受精后的第 6天(6 dpf，day－post－fertilization)、第 9天(9 dpf)采用蔡氏显微成像系统(Carl Zeiss AxioVision)对斑马鱼仔鱼进行拍照，并用图像处理软件AxioVision Rel.4.6.3测量仔鱼体长、头长、头宽、吻宽等形态学参数。

斑马鱼仔鱼行为测试在培养皿中完成，培养皿直径为9 cm，内盛有水或相应浓度的PFOS暴露液30 mL，暴露液浓度与暴露期间浓度一致，水温(24±1)℃。在培养皿下铺有一层含有若干等大正方形小方格的纸(图1)，每个方格边长约4.74 mm。试验时，将斑马鱼仔鱼轻轻用吸管吸出，置入培养皿中，并适应5 min，之后用摄像机(SONY DCR－SR200E，JAPAN)拍摄记录斑马鱼仔鱼的运动行为，连续拍摄5 min，录像资料随后在电脑上进行分析，采集各行为指标的发生频次。本研究以5 min内运动仔鱼比例、仔鱼的运动距离(游过的方格数)、停顿频率、最大持续运动距离、平均每次运动距离等指标评价其运动表现。分别于暴露第6天、第9天开展行为学实验，每尾斑马鱼仔鱼仅用于一次实验操作。为减少人为误差，录像资料由专人负责记录分析。

1.4 数据处理

应用软件SPSSfor Windows 16.0(SPSSInc.，USA)对数据进行统计分析。首先对实验数据进行正态性和方差齐性检验，采用单因素方差分析(ANOVA)和最小显著差数法(LSD)检验差异显著性;若数据不符合正态分布或方差不齐，则采用Kruskal－Wallis检验差异显著性。χ2－检验对“运动斑马鱼仔鱼比例”进行统计分析。各组数据均用平均值±标准误表示，显著性水平设为α=0.05。

图1 行为测试装置示意图Fig.1 Diagram of the grid pattern laid on the underside of a standard petri dish used as the behavioral testing arena

2 结果

2.1 胚胎孵化率

PFOS暴露对斑马鱼108 hpf的胚胎孵化率影响显著(χ2=20.1;P=0.017)，10 mg/L PFOS暴露导致斑马鱼108 hpf胚胎孵化率显著下降(P=0.002)(图2);PFOS暴露对斑马鱼胚胎120 hpf的孵化率影响显著(χ2=20.8;P=0.013)，10 mg/L PFOS暴露导致斑马鱼120 hpf胚胎孵化率显著下降(P=0.04)(图2)。120 hpf之后，各处理组均不再有新的斑马鱼仔鱼成功孵出。10 mg/L PFOS暴露组120 hpf的孵化率较108 hpf的孵化率显著升高(P=0.03)，其余各组120 hpf的孵化率与其108 hpf的孵化率相比无显著性差异(P＞0.05)，表明10 mg/L PFOS暴露致使斑马鱼胚胎孵化延迟。

2.2 仔鱼畸形率、死亡率

PFOS暴露6 dpf对斑马鱼孵出仔鱼死亡率与畸形率的影响见图3。PFOS暴露对斑马鱼仔鱼死亡率影响显著(χ2=93.6，P＜0.001)，10 mg/L PFOS暴露导致斑马鱼仔鱼死亡率显著升高(P＜0.001)，其余各组与对照组相比无显著性差异(P＞0.05)。PFOS暴露对斑马鱼仔鱼畸形率影响显著(χ2=97.6，P＜0.001)，10 mg/L PFOS暴露导致斑马鱼仔鱼畸形率显著升高(P＜0.001)，其余各组与对照组相比无显著性差异(P＞0.05)。

图2 PFOS暴露对斑马鱼胚胎孵化率的影响Fig.2 Hatching rate of zebrafish embryos at 108 hpf and 120 hpf upon exposure to different concentrations of PFOS

图3 PFOS暴露6 dpf对斑马鱼死亡率与畸形率的影响Fig.3 Mortality and deformation rate of zebrafish larvae at 6 dpf upon exposure to different concentrations of PFOS

2.3 仔鱼心率

PFOS暴露对斑马鱼仔鱼心率的影响见图4。PFOS暴露4 dpf对斑马鱼仔鱼心率影响显著(F=27.1，P＜0.001)，暴露导致斑马鱼仔鱼心率增加。PFOS暴露8 dpf对斑马鱼仔鱼心率影响显著(χ2=22.8，P＜0.001)，PFOS暴露8 dpf后，10 mg/L PFOS暴露组斑马鱼仔鱼死亡率接近100%，一定浓度范围内，斑马鱼仔鱼心率随PFOS暴露的升高而增加。

2.4 仔鱼运动行为

2.4.1 PFOS暴露6 dpf对斑马鱼仔鱼运动表现的影响

PFOS暴露对运动斑马鱼仔鱼比例影响显著(χ2=9.05;P=0.029)，10 mg/L PFOS暴露导致运动仔鱼比例显著增加(P=0.026)(图5)。PFOS暴露6 dpf对斑马鱼仔鱼的最大持续运动距离影响显著(F=3.40;P=0.025)，10 mg/L PFOS暴露导致斑马鱼仔鱼单位时间内的最大持续运动距离显著增加(P=0.028)(图5B)。

图4 PFOS暴露4 dpf和8 dpf对斑马鱼仔鱼心率的影响Fig.4 Heart rate of zebrafish larvae at 4 dpf and 8 dpf upon exposure to different concentrations of PFOS

图5 PFOS暴露6dpf对运动斑马鱼仔鱼比例和最大持续运动距离的影响Fig.5 Proportion of motile individual and Maximum distance of continuous locomotion in zebrafish larvae at 6 dpf upon exposure to different concentrations of PFOS

2.4.2 PFOS暴露9 dpf对斑马鱼仔鱼运动表现的影响

PFOS暴露9 dpf后，10 mg/L PFOS处理组斑马鱼仔鱼死亡率达到100%。PFOS暴露9 dpf对斑马鱼仔鱼运动行为的影响见图6。PFOS暴露9 dpf对斑马鱼仔鱼运动距离的影响显著(F=33.3，P＜0.001)，斑马鱼仔鱼运动距离随PFOS暴露浓度升高而减少(F=31.7，P＜0.001)。PFOS暴露9 dpf对斑马鱼仔鱼停顿频率的影响显著(F=33.3，P＜0.001)，停顿频率随PFOS暴露浓度升高而下降。PFOS暴露9 dpf对斑马鱼仔鱼平均每次运动距离的影响显著(χ2=8.55，P=0.014)，1 mg/L PFOS暴露导致斑马鱼仔鱼平均每次运动距离显著减少(P=0.001)。PFOS暴露9 dpf对斑马鱼仔鱼最大持续运动距离的影响显著(χ2=6.78，P=0.034)，最大持续运动距离随PFOS暴露浓度升高而增加(图6)。

2.5 仔鱼生长

PFOS暴露对斑马鱼仔鱼生长的影响见表1。PFOS暴露6 dpf对斑马鱼仔鱼体长(F=18.8，P＜0.001)、头长(F=9.02，P＜0.001)、吻宽/体长(F=4.61，P=0.006)、吻宽/头长(F=7.79，P＜0.001)等影响显著，对头宽、吻宽等无显著影响(P＞0.05)(表1)。PFOS暴露9 dpf后，10 mg/L PFOS浓度处理组斑马鱼仔鱼死亡率达到100%。PFOS暴露9 dpf有导致斑马鱼仔鱼体长、头长下降的趋势，然而未达到显著水平(P＞0.05);PFOS 暴露 9 dpf对头宽(χ2=9.81，P=0.007)、吻宽(F=13.5，P＜0.001)、吻宽/体长(F=10.6，P＜0.001)、吻宽/头长(F=4.86，P=0.012)等均影响显著(表1)。其中，斑马鱼仔鱼吻宽/体长、吻宽/头长随PFOS暴露浓度的升高，呈现出先下降后升高的趋势;例如，PFOS暴露6 dpf，0.1 mg/L PFOS暴露导致斑马鱼仔鱼吻宽/体长显著下降(P=0.027)，1 mg/L和10 mg/L PFOS暴露组与对照组相比无显著性差异(P＞0.05);PFOS暴露9 dpf，0.1 mg/L PFOS暴露导致斑马鱼仔鱼吻宽/体长显著下降(P＜0.001)，而1 mg/L PFOS暴露组与对照组相比无显著性差异(P＞0.05)(表1)。

图6 PFOS暴露9dpf对斑马鱼仔鱼运动行为的影响Fig.6 Locomotor behavior of zebrafish larvae at 9 dpf upon exposure to different concentrations of PFOS

表1 PFOS暴露对斑马鱼仔鱼生长的影响Table 1 Growth of zebrafish larvae at 6 dpf and 9 dpf upon exposure to different concentrations of PFOS

3 讨论

PFOS广泛存在于水生生态系统，其污染如今已经成为全球性的环境问题［1，9，23］。有研究表明，PFOS对浮游动物群落和大型水生植物浮萍(Lemna gibba)的无可见效应浓度(No－observed－effect concentration，NOEC)分别为3 mg/L和0.2 mg/L［24］。Van Gossum 等［25］的研究表明，PFOS暴露1个月和4个月对豆娘(Enallagma cyathigerum)幼虫活动水平的NOEC分别为0.1 mg/L与0.01 mg/L。本研究中，PFOS暴露对斑马鱼仔鱼心率、运动表现、吻宽/体长、吻宽/头长等的最低可见效应浓度(Lowest－obvious－effective concentration，LOEC)为0.1 mg/L，表明斑马鱼仔鱼心率、运动行为、吻宽/体长、吻宽/头长等对PFOS较为敏感，是评估水体PFOS污染敏感而有效的生物标志物。0.1 mg/L已接近某些地区水体PFOS的污染水平［10］，加之PFOS的难降解性及其在生物体的易蓄积性［3，8］，PFOS对野生动物和人类健康的潜在威胁不容忽视。

PFOS具有发育毒性。PFOS暴露可以损伤细胞膜，增加细胞膜的流动性与通透性［26］。叶露等发现高浓度(＞240 mg/L)PFOS暴露导致斑马鱼胚胎分裂中的细胞发生自溶而卵凝结死亡，抑制胚胎原肠胚的形成［17］。Bots等的研究表明，PFOS暴露导致豆娘孵化率降低、幼虫发育迟缓、死亡率升高，并降低变态成功率;幼虫对PFOS的敏感性较卵高出1000倍，其NOEC分别为0.01 mg/L与10 mg/L［27］。Shi等的研究表明，PFOS暴露可以导致斑马鱼胚胎细胞凋亡和发育畸形增多，p53和Bax等细胞凋亡相关的基因表达量显著升高［28］。本研究中，PFOS暴露对斑马鱼胚胎孵化率影响显著，10 mg/L PFOS暴露导致斑马鱼胚胎孵化延迟，孵化率下降、为对照组的81%，PFOS暴露6 dpf还导致斑马鱼仔鱼累积畸形率和死亡率升高，研究结果与Bots等［27］和Shi等［28］相一致。此外，4 dpf和8 dpf斑马鱼仔鱼心率随PFOS暴露浓度的升高而增加，呈剂量依赖的毒理学效应。心率的增加可能与PFOS暴露引发的应激反应有关，也可能是PFOS暴露导致的斑马鱼仔鱼发育障碍、心脏畸形、心率不齐所致［28］，PFOS暴露还有可能通过改变细胞膜表面势能影响细胞膜上的Ca2+通道，从而对心肌细胞产生毒性［29］。

PFOS具有行为毒性。行为是动物响应外界环境变化的整体终端反应，是环境污染物质对动物在分子、生化、生理水平上产生效应的综合体现，故而可为POPs的毒理学效应提供重要的生态指示［30－32］。运动表现与动物的健康和适合度密切相关，是评估POPs污染重要的生物标志物［31，33］。多环芳烃菲(phenanthrene)暴露显著影响乌颊鱼(Sparus aurata)的活动水平，0.05 mg/L和0.1 mg/L菲暴露可以分别导致乌颊鱼不运动个体的比例达到23.2%与38.6%，Correia等认为乌颊鱼主要采取运动对策还是解毒对策存在一个能量分配上的权衡(trade－off)，其活动水平的降低是因为需要花费更多的能量用于对毒物的降解［34］。Van Gossum等研究表明，PFOS暴露显著抑制豆娘幼虫的活动水平，并导致其有效取食能力以及逃避被捕食风险的能力降低［25］。此外，杀虫剂乐果(dimethoate)暴露可以导致步行虫(Pterostichus cupreus)运动时间、平均运动速度、运动路径长度等表观活动水平的指标降低，同时导致其停顿频率以及转向次数等增加［35］。本研究中，PFOS暴露显著影响斑马鱼仔鱼的运动表现，导致6 dpf和9 dpf仔鱼的最大运动持续距离增加，特别是10 mg/L PFOS暴露组斑马鱼仔鱼出现明显的行为异常，运动的个体首先是长时间的停顿，然后表现出突发性的、神经质的、迅速的转圈游动等异常的运动行为，这可能是由于PFOS暴露干扰了仔鱼中枢神经系统发育、破坏了胆碱能系统功能所致［36］;PFOS暴露9 dpf导致斑马鱼仔鱼的总体活动水平降低，表现为单位时间内的运动距离、停顿频率、平均每次运动距离等均随PFOS暴露浓度的升高而减少，呈剂量依赖的毒理学效应，研究结果与Van Gossum等［25］和Correia等［34］相一致。目前，PFOS影响鱼类运动行为的确切机制尚不明确。近期的研究表明，PFOS影响新生小鼠脑神经元生长和突触发生相关的重要蛋白的表达，导致海马CaMKII、GAP－43以及突触素水平增加［19］，并且影响大鼠海马钙依赖的信号分子的基因表达(例如NR2B、CaM、CaMKIIα以及CREB等)，从而可能导致动物运动缺陷［37－38］。

PFOS暴露抑制仔鱼生长。PFOS暴露可能通过“下丘脑－垂体－甲状腺轴(hypothalamus－pituitary－thyroid axis)”干扰甲状腺机能，并最终影响到肝脏胰岛素样生长因子IGF－I的合成，进而影响动物生长［39－40］。PFOS暴露对早期甲状腺发育相关的基因影响显著，能够导致hhex表达量升高，而对pax8的影响呈现“倒U型”非单调剂量－效应［28，41］。本研究中，PFOS暴露导致斑马鱼仔鱼体长下降或有下降的趋势，研究结果与Du等［16］和Shi等［28］相一致。PFOS暴露还导致斑马鱼仔鱼吻宽显著减小或有减小的趋势，对仔鱼吻宽/体长、吻宽/头长的影响显著。6—9 dpf是斑马鱼仔鱼从内源营养到混合营养的食性转化阶段，是仔鱼死亡敏感期，吻宽和吻宽/体长的大小可以间接反映出斑马鱼仔鱼的摄食能力，PFOS暴露导致吻宽和吻宽/体长减小，将可能导致斑马鱼仔鱼摄食能力与存活率降低。

综上所述，PFOS对斑马鱼胚胎及仔鱼具有显著的发育与行为毒性。PFOS暴露导致斑马鱼胚胎孵化率下降、孵化延迟、心率增加、仔鱼死亡率与畸形率升高、并抑制仔鱼生长;仔鱼的运动表现受PFOS影响显著，暴露引起仔鱼的异常行为增多、活动水平下降;此外，PFOS暴露导致斑马鱼仔鱼吻宽和吻宽/体长减小，将潜在的影响其摄食能力进而影响生存适合度。

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