加味当归补血汤对大鼠脑缺血再灌注损伤的神经保护作用研究*

高晓兰，朱增强

(1.甘肃中医学院人体解剖与组织胚胎学教研室，甘肃兰州730000;2.兰州石化总医院肿瘤血液科，甘肃兰州730060)

研究防止脑缺血再灌注后神经损伤的药物，寻找有效的方法促进脑卒中后神经元的功能恢复，一直是相关生命学科研究的重要课题。缺血性脑卒中的主要病理过程是脑部的缺血再灌注损伤。海马区对缺血缺氧比较敏感，脑缺血再灌注损伤可造成海马区锥体细胞迟发性坏死［1］。脑红蛋白(neuroglobin，NGB)是新近发现的神经系统特异性携氧蛋白，与脑内氧的运输、贮备和利用密切相关［2］。当归补血汤有补气益血之功效，有研究表明加味当归补血汤可促进心肌代谢，解除冠状动脉痉挛，减轻心肌的缺血性损伤［3］。有关加味当归补血汤对实验动物脑缺血再灌注损伤的作用和机制研究并不多见。本实验观察了加味当归补血汤对大鼠脑缺血再灌注损伤后海马各区NGB阳性神经元的表达和脑组织梗死体积的影响，以期从而探讨加味当归补血汤对大鼠脑缺血再灌注损伤后的神经保护作用及其相关机制。

1 材料与方法

1.1 动 物

Wistar大鼠60只，雌雄不限，体质量22～280 g，由甘肃中医学院实验动物中心提供，合格证号:SCXK(甘)2011－0001。

1.2 药品、试剂与仪器

加味当归补血汤组方:黄芪100 g，党参100 g，当归20 g。药物均购自兰州德生堂大药房，所有药物先添加少量蒸馏水浸泡1 h，再分别加1 000 mL和500 mL蒸馏水煎煮2次，每次1 h，最后合并2次药液，滤纸过滤、，浴锅蒸发浓缩至浓度为1 g生药/mL备用，使用时再加蒸馏水配制成所需浓度。200 g/L乌拉坦，上海化学试剂厂产品，批号110412;NGB多克隆抗体和相应标记二抗，购自Santa Cruz公司;浓缩型SABC(Strept Avidin-Biotin Complex)免疫组化染色试剂盒(批号201012)、二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)显色试剂盒(批号 K12613B)以及 2，3，5－氮化三苯基四氮唑(Triphenyl tetrazolium chloride，TTC)染色试剂盒(批号F20080102)，购自北京中杉金桥生物技术有限公司。其他试剂由甘肃中医学院医学实验中心病理实验室提供。BI－2000型医学图像分析系统，成都泰盟科技有限公司提供;AO－82型轮转式切片机，产地美国;FA2004N型电子分析天平，上海精科天平厂产品;Olympus CH－212型光学显微镜，日本Olympus公司产品;台式离心机，金坛市恒丰仪器厂产品;PYX－PHS－B型隔水式电热培养箱，上海跃进医疗器械厂产品。

1.3 模型的建立、分组与给药

大鼠在实验室环境适应性饲养7 d后，开始以线栓法［4］制备脑缺血再灌注损伤模型。大鼠术前禁食8～12 h后，以200 g/L乌拉坦(750μg/g)腹腔注射麻醉，仰卧固定于固定架上，颈部皮肤备皮、消毒，正中稍左侧切口，分离皮下组织，在胸骨舌骨肌与胸锁乳突肌之间找到大血管，触摸有搏动感，即颈总动脉。分离左侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，在距颈总动脉分叉处1 cm位置结扎左侧颈外动脉，同时动脉夹夹闭左侧颈总动脉，提起左侧颈外动脉游离端使其与颈内动脉成一直线，于颈外动脉结扎处近心端约0.5 cm位置剪一小切口，以左侧颈总动脉分叉处为标记，将一尼龙线经左侧颈外动脉切口处缓慢向颈内动脉方向推进，推进18～20 mm感受到轻微阻力时即为阻断了大脑中动脉。阻断2 h后，拨出尼龙线，扎紧动脉残端，缝合伤口，完成大鼠脑缺血再灌注损伤模型的建立。假手术对照组除不插线外，其他过程同上。60只实验大鼠中有15只或因手术麻醉、出血死亡、或不符合模型标准被弃。将余下45只随机分为以下3组:假手术及生理盐水灌胃对照组(A组)，局灶性脑缺血损伤再灌注及生理盐水灌胃组(B组)，局灶性脑缺血再灌注损伤及加味当归补血汤灌胃给药组(C组)，每组15只。造模术后第2天起开始给药，C组大鼠以加味当归补血汤10 mg生药/g体质量灌胃，A、B两组大鼠以生理盐水10μL/g体质量灌胃，每天2次，连续2周。

1.4 检测指标

末次给药后将各组大鼠断头取脑，置于40 g/L多聚甲醛固定液中12 h，常规石蜡包埋，取两耳极连线前6 mm左右冠状切面，切片厚7μm，4℃冰箱保存备用。

1.4.1 海马各亚区及齿状回NGB免疫反应及阳性细胞数

SABC免疫组织化学染色法检测。石蜡切片常规脱蜡至水化，用1∶50过氧化氢－甲醇混合液(20 ℃)处理30 min，0.01 M PBS缓冲液漂洗3 次;将载玻片放入湿盒，滴加正常山羊血清封闭液，室温(20℃)放置30 min，不洗;滴加NGB多克隆抗体，4℃冰箱过夜后，0.01 M PBS缓冲液洗涤3次;滴加兔抗大鼠IgG，室温(20 ℃)孵育30 min，0.01 M PBS缓冲液洗涤3次;滴加SABC，室温(20℃)孵育30 min，0.01 M PBS缓冲液洗涤3次;室温下DAB显色，镜下控制反应时间，以NGB阳性神经元呈棕黄色、背景为淡黄色为度，蒸馏水洗涤;梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性塑胶封片后显微镜观察大鼠海马各亚区及齿状回(dentate gyrus，DG)组织切片，取每张切片5个高倍视野，计算NGB免疫反应阳性细胞数。

1.4.2 脑组织梗死体积

以TTC染色法检测。将大鼠断头取脑速冻后，取视交叉后方连续2 mm脑组织冠状切片，放置于20 g/L的TTC染液中;于37℃恒温孵育15 min，梗死区脑组织呈现灰白色，而正常脑组织呈现鲜红色;将显色后的脑组织切片放置于40 g/L多聚甲醛缓冲液中固定24 h;分离出梗死区脑组织，电子天平称质量，然后以梗死区脑组织的质量占缺血区脑组织质量的百分比作为相对梗死体积。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠海马区NGB免疫组化染色结果及阳性细胞数对比

免疫组化染色后，A组大鼠海马区神经元胞体及突起内有棕黄色的NGB阳性颗粒，排列整齐。B组大鼠海马各区及齿状回NGB阳性细胞分布稀疏，数目较A组、C组明显减少，差别有统计学意义(P＜0.05)。见图1和表1。

表1 高倍镜下各组大鼠海马各亚区及齿状回NGB阳性细胞数对比 个±s

表1 高倍镜下各组大鼠海马各亚区及齿状回NGB阳性细胞数对比 个±s

注:与A组对比，*P＜0.05;与 B组对比，#P＜0.05。

组 别 动物数CA1 CA2 CA3 DG A 组 15 18.20 ±0.15 17.62.±1.06 17.93 ±1.15 14.16 ±2.61 B 组 15 11.31 ±0.411 10.85 ±1.13* 10.67 ±1.05* 9.01 ±0.29*C 组 15 15.63 ±0.162 14.41 ±1.52# 15.01 ±0.26# 12.81 ±0.35#

2.2 各组大鼠脑组织梗死体积对比

C组较B组能在一定程度上减少大鼠脑缺血再灌注损伤后的脑组织梗死范围，差别有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

表2 各组大鼠脑组织梗死体积对比 ±s

表2 各组大鼠脑组织梗死体积对比 ±s

注:与B 组对比，#P ＜0.05。

组别 动物数/只 脑组织梗死体积/%A组15 0.00 ±0.00 B 组 15 29.87 ± 1.32 C 组 15 20.50 ± 0.08#

3 讨论

脑缺血再灌注损伤属于中医学“中风”范畴，病机为脏腑阴阳失调，气血逆乱，脑脉闭阻。因此治疗中风的基本原则为补益气血、行气活血、疏通脑脉、滋养脑髓［5］，改善脑部缺血缺氧症状。当归补血汤是中医补气生血代表方剂，方中重用黄芪大补脾气，以资气血生化之源，使气旺血生;同时配以少量甘辛而温的当归养血和营，则阳生阴长，脾运得健，气旺血生［6］;加味药党参亦具有较强的补气益血功效。三药配伍，扶正固本，标本兼治。NGB与脑组织对氧的利用密切相关，增加脑内NGB的表达对神经元有明显的保护作用［7］。目前认为:大脑海马区(尤其是CA1区)是对缺血缺氧性损伤耐受性最差的区域［8］。研究发现:NGB主要参与氧在中枢神经系统中的转运与贮存，在神经系统的氧摄取、运输和利用等过程中起着极其重要的作用，是一种内源性神经保护因子，在脑保护、改善神经功能和预后等方面起着重要的作用［9］。缺血性脑损伤后遗症的发生和神经再生障碍相关。一直以来，人们普遍认为受损的神经细胞不能再生的主要原因是缺乏神经保护因子等调节因素。Khan等［10］研究发现:脑组织中NGB的表达增加可以降低转基因小鼠的脑梗死体积，提示NGB在脑缺血缺氧性损伤中对神经元有保护作用。

本研究结果表明:大鼠脑缺血再灌注损伤后NGB免疫反应阳性神经元的表达数目显著降低，而加味当归补血汤能够增加大鼠脑缺血再灌注损伤后海马区NGB阳性神经元的表达，同时一定程度上减少了脑缺血再灌注损伤后大鼠的脑组织梗死体积。此证明加味当归补血汤的配方选材及其对脑缺血再灌注损伤的疗效是可以肯定的，但因脑缺血再灌注损伤后的神经修复机制十分复杂，加味当归补血汤为中药复方，故其对脑缺血再灌注损伤的神经保护作用及其相关机制还有待做进一步研究。

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［2］Burmester T，Weich B，Reinhardt S，et al.A vertebrate globin expressed in the brain［J］.Nature，2000，407(6803):520－523.

［3］刘康永，石美雅，林迈，等.中西医结合治疗冠心病84例疗效观察［J］.中国中西医结合杂志，1997，17(2):128.

［4］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20(1):84 －91.

［5］周凌云，罗亚非，娄金波，等.当归补血汤对局灶性脑缺血再灌注损伤后大鼠神经功能影响［J］.实用中医药杂志，2012，28(4):292 －293.

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［9］Zhang C，Wang C，Deng M，et al.Full-length cDNA cloning of human neuroglobin and tissue expression of rat neuroglobin［J］.Biochem Biophys Res Commun，2002，290(5):1411 －1419.

［10］Khan AA，Wang Y，Sun Y，et al.Neuroglobin-overexpressing transgenic mice are resistant to cerebral and myocardial ischemia［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2006，103(47):17944－17948.