甲壳低聚糖的酶法制备及其在医药中的应用

王振伟，王哲嵘

（黄河水利职业技术学院，河南 开封 475004）

0 引言

甲壳低聚糖是壳聚糖经过物理方法、化学方法或者酶法降解后的低聚物，其分子量大小、分子量范围以及乙酰基残基、乙酰基分布等取决于所用原料壳聚糖的种类、所采用的降解方法、所使用酶的特异性等。 目前，国内外的研究大多关注壳聚糖的生物效应，而对于其降解后的甲壳低聚糖的生物活性的分子作用机制、精细化制备及应用等的研究相对较少。 根据文献报道，甲壳低聚糖应用在医药中时，可以作为抗哮喘药物、抗菌剂、伤口敷料组成成分和基因治疗的缓释载体，它还可以抑制肿瘤细胞的生长和扩散， 提高骨质疏松症患者的骨强度，预防疟疾等[1]。 同时，甲壳低聚糖还有免疫调节作用，富有抗真菌活性，能够有效降低肝脏和血清中的胆固醇、血压、血糖和血脂等[2～3]。 本文着重研究目前甲壳低聚糖的酶制备方法、降解产物的分离纯化与表征，及甲壳低聚糖在医药中的应用等。

1 酶法制备甲壳低聚糖分析

甲壳低聚糖的制备包括物理法、化学法和酶法，以及由这些方法派生出的适合实际生产的复合法等。 物理法和化学法对壳聚糖的降解有一定的作用，但会产生环境污染，产物分子量不易控制，还可能引起交联和歧化反应等，难以得到较纯的甲壳低聚糖。 与物理、化学降解方法相比，酶法制备甲壳低聚糖具有许多优点，如反应条件温和，可选择性地切断β-1,4 糖苷键，反应过程不需要大量试剂，降解产物分子量易于控制，制备的甲壳低聚糖生物活性高等。 同时，通过改变使用的酶的种类及组合，可以得到所需分子量范围的低聚糖。 目前，用于降解壳聚糖的酶分为专一性用酶和非专一性用酶两类。

1.1 专一性酶降解法

在专一性酶中，被研究较多的是壳聚糖酶。 这种酶主要来源于真菌，在植物组织中也有分布。 壳聚糖酶水解底物作用化学键位点不同，导致降解产物聚合度的不同， 其最适宜的pH 值为4.0～6.8，产物多是聚合度为2～8 的低聚糖。 如BacilluscereusS1 来源壳聚糖酶水解底物产生的甲壳低聚糖聚合度为2～4，主要是三聚体；Miyake 等[4]用牙孢杆菌属产生的脱乙酰壳聚糖酶在50℃下降解10 h，得到了聚合度为8 的甲壳低聚糖，而Rhodotorulagracilis来源的壳聚糖酶催化产生的产物相对分子质量为9500[5]。 不同来源的壳聚糖酶除了水解位点不同外，其最适宜温度（30℃～80℃）差别也较大。

甲壳素酶也是一类重要的专一性用酶，包括甲壳素外切酶、内切酶及β-N-乙酰氨基葡萄糖酶。 甲壳素酶在发生作用时，先由降解酶催化水解甲壳素的糖苷键。 外切酶以甲壳二糖为单位，从甲壳素的非还原端开始酶切；内切酶则随机水解糖苷键。 同时， 外切酶水解成的甲壳二糖被β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶水解成单糖。 一些β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶也有较弱的外切酶活性，从甲壳素的非还原端开始直接水解成单糖。

溶菌酶是另一类被研究比较多的专一性用酶。溶菌酶除了能够水解某些细菌细胞壁的肽聚糖外，也能够水解甲壳素和壳聚糖。 在早期的研究中，Amano and Ito 等人[6]研究了溶菌酶降解壳聚糖分离，得到了完全N-乙酰化的三聚体和四聚体。

1.2 非专一性酶降解法

近年来的研究发现，许多种酶对壳聚糖具有非专一性水解作用,也可用来催化水解壳聚糖，得到相对分子量较低的产品。 非专一性酶价廉易得，因而就成为近年来制备甲壳低聚糖的研究热点。 采用非专一性酶对壳聚糖进行降解，酶种不同，降解速度也不同。 从作用效果来看，虽然各类非专一性酶似乎并不存在共同的催化基团，但大都能制备水溶性的低分子质量的壳聚糖。 陈江燕等研究了纤维素酶对壳聚糖的降解作用，得到的水解产物有氨基葡萄糖和它的二糖、三糖和四糖[7]。 胃蛋白酶降解壳聚糖得到的主要是平均聚合度为16 的甲壳低聚糖[8]。 何新益等使用由蛋白酶、果胶酶、纤维素酶组合而成的复合酶水解壳聚糖，得到了相对分子量低于4 000 的甲壳低聚糖。

1.3 不同酶降解壳聚糖的效果比较

专一性酶和非专一性酶制备甲壳低聚糖各有优缺点，其作用方式、产物性质等各有不同。 两种酶降解方式及效果比较如表1 所示。

表1 专一性酶和非专一性酶降解效果比较Table 1 Comparison of specific enzyme and non-specific enzyme degradation effect

自然界中的壳聚糖绝大部分由甲壳素酶和壳聚糖酶催化水解成小分子。 但是，商品化的壳聚糖酶的价格昂贵,不易得到，限制了专一性壳聚糖酶的应用。 非专一性酶法能制备水溶性相对分子质量低的壳聚糖，但也存在着生产周期长、生理生化活性低、酶添加量较多等缺点。 不过，与其他降解方法相比，酶法仍是最理想的降解方法。

2 甲壳低聚糖的纯化与表征分析

2.1 产物的分离纯化

由酶法制备的甲壳低聚糖通常是在一定分子量分布范围内的低聚物混合物，需要采用一些技术手段加以分离、纯化，从而得到单一分子量或一定分子量范围内较纯的甲壳低聚糖。 酶法制备的甲壳低聚糖分离纯化技术包括调节体系的pH 值、过滤、离心、透析、真空（或冷冻）干燥发挥等。 在一般情况下，这些技术手段需要组合起来、共同发挥作用，才能获得较为均匀的甲壳低聚糖片段。 尽管在甲壳低聚糖纯化方面取得了一些成功，但生产纯的低聚糖仍然是一个耗时较多而且具有挑战性的任务。

依据甲壳低聚糖相对分子量的大小，最常见的制备分离方法是分子排阻色谱法（SEC）。最近，已经描述了聚合度为40 的低聚糖的分离方法。 用于制备甲壳低聚糖的排阻色谱系统所用的是Superdex30柱，示差折光检测器可以检测到制备的低聚物[8]。

甲壳低聚糖的进一步分离可以采用阳离子交换层析法，因为脱乙酰后的糖的质子化氨基集团可以与离子交换材料相互作用。 此方法可以获得相同聚合度的甲壳低聚糖。 在其他的方法中，金属离子亲和层析法已成功地用于分离较短片段的甲壳低聚糖。

2.2 甲壳低聚糖产物的表征

高效液相色谱（HPLC）可用来鉴定壳聚糖的降解产物，凝胶渗透色谱（GPC）可测定甲壳低聚糖分子量及其分布。 陈江燕等用HPLC 研究壳聚糖降解物， 分析结果说明， 在保留时间6.142 min、6.181 min、7.183 min、8.162 min 4 处出现峰， 分别是氨基葡萄糖的单糖、二糖、三糖和四糖[7]。 另外，纸层析、紫外吸收光谱、核磁共振分析（NMR）、基体辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI TOF MS）等技术也常用于甲壳低聚糖的表征[9]。

3 甲壳低聚糖在医药中的应用

甲壳低聚糖应用在医药中的主要作用是可以抑制肿瘤生长、增强骨骼强度，用于基因治疗，抵抗细菌浸染，加快伤口愈合等。

3.1 抑制肿瘤生长

关于甲壳低聚糖的抗肿瘤作用的报道最早出现在20 世纪70 年代。 有证据证明，甲壳低聚糖在减少肿瘤转移方面具有积极的作用。 Maeda and Kimura 等人的[10]研究发现，甲壳低聚糖能够提高淋巴细胞的杀伤活性，减少小鼠体内肿瘤的生长。 这表明，甲壳低聚糖所具有活化肠道免疫系统的功能能够用于治疗肿瘤。

甲壳低聚糖能够诱导细胞凋亡，从而抑制肿瘤细胞增殖。 最近几年，有关甲壳低聚糖抑制血管生成，从而抑制肿瘤生长方面的研究也得到了更多的关注。 血管生成是指从已有的血管形成新的毛细血管。 由于肿瘤生长和转移需要血管提供营养，没有血管供血，肿瘤不会长大。 所以，抗肿瘤生长在肿瘤治疗中有极其重要的价值。 Xiong C.等[11]比较了完全脱乙酰化的甲壳低聚糖的二聚体和六聚体对血管生成的影响，发现六聚体是血管生成最有效的抑制剂。 而Wang S L 等人[12]的研究则表明，与N-乙酰化的甲壳低聚糖相比，完全脱乙酰化的甲壳低聚糖无论是在体外还是在体内都能更有效地防止血管生成。

3.2 增强骨骼强度

骨髓间充质干细胞能够分化成软骨细胞 （软骨）、脂肪细胞（脂肪）和成骨细胞（骨）。 成骨细胞生成类骨质，并进一步矿化，产生骨基质。 骨组织主要由骨基质和成骨细胞构成。 壳聚糖和甲壳低聚糖增加成骨细胞和骨髓间充质干细胞的分化，从而促进骨组织的形成。 有充分证据证明，甲壳低聚糖能够增加钙沉积于骨骼里的比例。Jung 等人[13]发现，甲壳低聚糖可以有效地抑制磷酸钙盐的形成，从而增加钙的生物利用度和骨强度。 他们还发现，甲壳低聚糖（＜5kDa）能够促进骨质疏松型大鼠的骨钙沉积，抑制破骨细胞活性，从而抑制骨吸收、降低骨转换。在Ca2+不足的条件下，如在骨质疏松症中，甲壳低聚糖可能会作为钙强化剂，产生有益的作用[14]。

3.3 基因治疗

1995 年，壳聚糖就作为靶向基因的载体，用于基因治疗。 壳聚糖与质粒DNA 形成稳定的配合物，可以用作黏膜组织（如肺）和肠上皮细胞中基因给药的载体[15]。但是，高分子量的壳聚糖存在着在生理pH 条件下溶解度低的缺点。 通过使用甲壳低聚糖而不是壳聚糖， 可能会克服这些缺点。 Köping-Höggård 等人的研究[16]表明，完全脱乙酰基的甲壳低聚糖（聚合度为24）无论是在体外还是体内，均能够与质粒DNA 形成稳定的复合物。 据推测，甲壳低聚糖-DNA 复合体在pH 值约为6 时的不稳定性与在pH 值高于7 时的稳定性之间存在着微妙平衡，是其具有高效率的原因。

3.4 抵抗细菌浸染

甲壳低聚糖的抗感染作用已经被许多学者所证实。 关于其作用的机制，有以下几种解释：（1）将巨噬细胞直接激活，从而增加其杀伤活性。 （2）激活T 淋巴细胞，而显示杀伤活性，且致敏T 细胞诱发迟发性超敏反应。 （3）激活T 淋巴细胞。 T 淋巴细胞能够促进巨噬细胞激活因子的释放，从而激活巨噬细胞，增加杀伤活性[17]。 甲壳低聚糖含有N-乙酰-D-糖胺（GlcNAc）或D-糖胺（GLcN）基团，一些免疫细胞表面含有Glc-NAc 或GLcN 残基受体，当这些受体与壳聚糖结合后，可活化免疫细胞。 Tokoro 等人的研究[18]发现，甲壳低聚糖通过细胞免疫功能而对单核细胞增多性李斯特菌具有很强的抑制生长作用。

3.5 伤口敷料

甲壳低聚糖具有加速伤口愈合的积极作用。 壳聚糖作为硬组织激发剂，具有固定肝素、硫酸软骨素和葡聚糖的功能，可以有效地刺激硬组织，尤其是骨组织的恢复和再生，从而促进关节软骨损伤的愈合。 壳聚糖可由天然存在的酶降解为甲壳低聚糖，其观察到的活性，实际上很可能是由酶降解后产生的甲壳低聚糖引起的[19]。因此，使用生物利用度更好的甲壳低聚糖作为伤口敷料，可以得到更直接的治疗效果。 甲壳低聚糖被认为是具有加强炎症和修复细胞的功能，从而能够加速伤口愈合。

壳聚糖与甲壳低聚糖的止血效果也可能有助于伤口愈合。 壳聚糖能够增强血小板的黏附和聚集， 从而增加血液中血小板衍生生长因子AB（PDGF-AB）、转化生长因子-β1（TGF-β1）的释放[20]。在伤口愈合过程中，这两个生长因子被认为是很重要的炎症细胞。 完全脱乙酰化的甲壳低聚糖在治疗伤口上较为有效， 因为源于D-糖胺给了胶原酶最高活性，而胶原酶主要由成纤维细胞和炎症细胞产生，其活性的高低与伤口愈合直接相关。

4 结语

甲壳低聚糖具有重要的生理活性，且能克服壳聚糖在中性溶液中难以溶解的缺点，市场潜力巨大。近年来， 它受到相关领域研究人员的广泛重视，他们在酶法生产菌株的筛选或重组表达、反应催化剂选择、酶法降解底物特性、用物理化学方法降解产物性质等方面进行了诸多研究。 随着研究的逐步深入，甲壳低聚糖具有广泛的生物活性这一点已经得到充分的证实，下一步的研究方向将会是甲壳低聚糖制剂的精细化制备及其生物活性的分子作用机制。

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