响应面法优化百香果醋的发酵条件

霍丹群，蒋 兰，王 霜，杨 平，3，马璐璐，徐 勇，3，侯长军

(1.重庆大学生物工程学院，重庆400044;2.重庆大学弘深学院，重庆400044;3.国家固态酿造工程技术研究中心，泸州老窖股份有限公司，四川泸州646000)

百香果又称西番莲、巴西果、鸡蛋果，是西番莲科(Passifloraceae)多年生木质藤本植物果实的通称，因其果汁可散发出菠萝、香蕉等多种水果的浓郁香味，故得名百香果。它是世界上已知最香的水果之一，被国内外誉为“果汁之王”［1-2］。国内外大量实验研究表明，百香果还具有抗炎、抗焦虑、降血脂、降血压等多种保健功能［3-8］。随着人们生活水平的提高和保健意识的增强，果醋越来越受到人们的关注。一方面，果醋营养丰富，并有很好的食疗功效，能够辅助治疗糖尿病和高血压，还有美容、减肥效果［9-12］;另一方面，果醋酿造技术的发展，为缓解鲜果滞销和果品资源的加工利用提供了一条有效的解决途径。本研究以重庆区域种植的百香果为原料，对果醋酿制工艺条件进行优化，以期为百香果醋的酿制提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

百香果 市售;安琪葡萄酒用高活性干酵母安琪酵母公司;醋酸菌 实验室保藏;果胶酶、氢氧化钠、酵母膏、碳酸钙、亚硫酸钠 重庆博艺化学试剂有限公司。

手持糖度计 天津镜象仪器公司;酒精浓度计河北武强仪表厂;恒温培养箱 上海森信实验仪器有限公司生产;恒温水浴锅 上海浦东荣丰科学仪器有限公司;PHS-3C精密p H计 上海精密科学仪器有限公司;立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂。

1.2 实验方法

1.2.1 工艺流程 百香果→清洗榨汁→粗滤→澄清→调糖度→酒精发酵→醋酸发酵→过滤→果醋配制→果醋饮料成品［13］。

1.2.2 操作要点

1.2.2.1 选果、洗净 选取新鲜、柔软适中、基本成熟的果实，剔除霉烂、病虫害果子后，用清水清洗3～4次。

1.2.2.2 榨汁、果胶酶处理 将清洗后的百香果榨汁后，加入果胶酶处理。4000活力单位的液体果胶酶用量为0.05%，温度为40℃左右，处理后所得果汁较澄清透明。

1.2.2.3 调整糖度 为了使酿成的酒质量好，并促使发酵顺利进行，澄清后的原汁需根据果汁成分及成品要求调整糖度和酸度。

1.2.2.4 菌种活化 酵母菌种子培养:将2.5g安琪酵母用含5%的蔗糖溶液50mL活化30min，待有大量小气泡产生即可;醋酸菌种子培养:将冻藏醋酸菌种子接种到含25mL种子培养基的250mL锥形瓶中，温度33℃，150r/min培养24h，作为一级种子，按5%的体积比将一级种子接种到种子培养基中，33℃，150r/min培养24h，作为二级种子。

1.2.2.5 酒精发酵 将果胶酶处理后的果汁90℃杀菌10min，然后接入一定量的经活化的酵母培养液，在密闭容器中进行，温度保持在28～32℃，发酵时间4d，当酒精含量为6.0%vol以上，转入醋酸发酵。发酵过程中应经常检查发酵液的温度、糖、酸及酒精含量等。

1.2.2.6 醋酸发酵 接入一定量的醋酸菌于酒精发酵醪中，发酵温度30～33℃。发酵时要不时搅拌或通入空气，并每天检查发酵醪醋酸含量，发酵时间为7d。

1.2.2.7 后处理 发酵完毕的果醋经粗滤，在醋液中加入适量的蔗糖等进行口味调和，制成百香果醋。

1.2.3 酒精发酵工艺条件的确定

1.2.3.1 酒精发酵工艺条件的单因素确定 250mL锥形瓶按装瓶量80%装瓶发酵，每个实验组重复3次，对酒精发酵的条件进行探索:温度(26、28、30、32、34℃，固定糖度14%，接种量 0.1%)、最初糖度(8%、10%、12%、14%、16%，固定温度 30℃，接种量0.1%)、接种量 (0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%，固定温度30℃，糖度14%)。

1.2.3.2 酒精发酵条件优化 根据单因素实验结果，依据正交实验原理对酒精发酵过程中的温度、糖度、接种量三个工艺参数进行优化。采用4因素3水平L9(34)的正交表进行实验设计，最后一列作为缺省项，每个因素选择3个水平。

表1 酒精发酵正交实验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment for optimizing the alcohol fermentation

1.2.4 醋酸发酵工艺条件的确定

1.2.4.1 醋酸发酵工艺条件的单因素确定 因醋酸菌为好氧菌，在250mL锥形瓶进行实验时按装瓶量30%装瓶发酵，每个实验组重复3次，对醋酸发酵的条件进行探索:温度(28、30、32、34、36℃，固定发酵酒精度6%，接种量11%);初始酒精度(5%、6%、7%、8%、9%，固定温度30℃，接种量11%);接种量(5%、8%、11%、14%、17%，固定发酵温度 30℃，酒精度6%)。

1.2.4.2 醋酸发酵条件优化 在单因素实验基础上，根据Box-Behnken中心组合实验设计原理，进行响应面分析方法对醋酸发酵三个因素进行优化。

表2 中心组合实验设计因素与水平表Table 2 Factors and levels in the central composite design

1.2.5 测定方法 酒精测定:酒精计法;总糖测定:糖度计法;总酸测定［14］:酸碱滴定法，以醋酸计;p H测定:精密pH计法;微生物检测:稀释平板计数法。

2 结果与讨论

2.1 酒精发酵工艺条件优化

2.1.1 不同温度对酒精发酵的影响 发酵温度分别是26、28、30、32、34℃，糖度 14%，酵母菌接种量0.1%，发酵结束测定酒精度，实验结果如图1所示。

图1 不同温度对酒精发酵的影响Fig.1 Effect of different temperature on alcoholic fermentation

从图1可知，随着温度的升高，发酵后酒精度呈先上升后下降的趋势。当温度为30℃左右时，酒精度最高。因为在一定范围内，微生物随着温度的升高，繁殖速度加快，但是当发酵温度过高时会使酵母代谢过于旺盛，造成酵母提前老化，妨碍色、香、风味的形成，还易造成杂菌滋生，不利于发酵实验的顺利进行。故选取30℃作为发酵过程的最适温度。

2.1.2 不同糖度对酒精发酵的影响 发酵糖度分别是8%、10%、12%、14%、16%，温度 30℃，接种量0.1%，发酵结束测定酒精度，实验结果如图2所示。

从图2可知，糖度在8%～14%之间，发酵产生的酒精度呈上升趋势，随后呈下降趋势。糖度高时产生的酒精度也相对较高，但糖度过高却会抑制酵母菌的生长，导致酒精度降低，故实验选取14%作为发酵初始糖度。

2.1.3 不同接种量对酒精发酵的影响 接种量分别为0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%，发酵温度30℃，糖度14%。发酵结束测定酒精度，实验结果如图3所示。

图2 不同糖度对酒精发酵的影响Fig.2 Effect of different sugar degree on alcoholic fermentation

图3 不同接种量对酒精发酵的影响Fig.3 Effect of different inoculation on alcoholic fermentation

从图3可知，酵母接种量过少，酒精发酵就会缓慢，生产周期相应延长。但接种量过大，发酵液里的营养物质主要用于菌体的繁殖，造成酒精度降低。综合考虑，选取0.15%作为酒精发酵的接种量。

2.1.4 酒精发酵正交优化 以单因素实验中获得的最适条件为基础，进行正交实验，考察温度、糖度、接种量对酒精发酵的影响，以酒精度为评价指标，所得结果如表3。

表3 酒精发酵L9(34)条件正交实验结果Table 3 Results and analysis of orthogonal experiment for the alcohol fermentation

根据表3的正交实验结果，由极差值R可以看出影响醋酸发酵的因素A＞B＞C，即酒精发酵温度＞糖度＞接种量。对正交结果进行方差分析，结果如表4 所示，FA＞ F0.05(2，2)，FB＜F0.05(2，2)，FC＜F0.05(2，2)，说明温度对酒精发酵差异显著，而糖度、接种量差异均不显著。结合R值和方差分析结果综合考虑，得出以下结论:优化方案为A2B2C2，即发酵温度30℃，糖度14%，接种量0.15%，按照最优实验条件进行发酵，最后酒精度为6.2%。

表4 酒精发酵正交实验结果的方差分析Table 4 Analysis of variance in orthogonal experiment of alcohol fermentation

2.2 醋酸发酵工艺条件优化

2.2.1 温度对酸度发酵的影响 发酵温度分别是28、30、32、34、36℃，发酵酒精度 6%，接种量 11%，发酵结束测定酸度，实验结果如图4所示。

图4 不同温度对醋酸发酵的影响Fig.4 Effect of different temperature on acetic acid fermentation

从图4可知，温度在28～32℃之间，发酵产生的酸度呈上升趋势;于32～36℃时，呈下降趋势。当温度为32℃左右时，酸度最高。当温度过低时，醋酸菌生长缓慢，产酸较低，但是温度过高，会造成菌体老化加快，因此确定醋酸发酵的最适温度为32℃。

2.2.2 酒精度对酸度发酵的影响 发酵初始酒精度分别是 5%、6%、7%、8%、9%，温度 30℃，接种量11%，发酵结束测定酸度，实验结果如图5所示。

图5 不同酒精度对醋酸发酵的影响Fig.5 Effect of different alcohol degree on acetic acid fermentation

从图5可知，随着酒精度的升高，发酵产生的酸度呈先上升后缓慢下降的趋势。当酒精度数为6%左右时，产酸量最大。当酒精度继续升高时，醋酸产量反而降低，因为在发酵初期，过高的酒精度，渗透压较高，这样会抑制醋酸菌的生长代谢，造成产酸下降。故确定醋酸发酵的最适酒精度为6%。

2.2.3 接种量对酸度发酵的影响 发酵接种量分别是5%、8%、11%、14%、17%，发酵温度30℃，酒精度6%，发酵结束测定酸度，实验结果如图6所示。

图6 不同接种量对醋酸发酵的影响Fig.6 Effect of different inoculation on acetic acid fermentation

从图6可知，当接种量为11%左右时，酸度最高。接种量大时菌体浓度高，发酵速率较快，但当接种量超过一定范围时，发酵体系中的营养物质会被在醋酸菌消耗，造成产酸量降低。综合考虑，选取11%作为醋酸发酵过程所需的接种量。

2.2.4 响应面优化结果与数据分析

2.2.4.1 模型方程的建立与显著性检验 醋酸发酵的响应面分析依据Box-Bebnken中心法则设计了15组实验，包括3组中心点重复实验，结果如表5所示。

利用Design Expert软件对表5的实验数据进行二次多项回归拟合，获得酸度(Y)对自变量温度(x1)、酒精度(x2)、接种量(x3)的多元回归方程:

表5 Box-Behnken中心组合设计方案及实验结果Table 5 Box-Behnken Experiments design and the results of these experiments

对得出的回归方程进行方差分析，结果如表6所示。由表6可知:模型p＜0.01(p＜0.0001)，说明本实验所选用的二次多项模型具有高度的显著性。失拟项p＞0.05(p=0.1808)，失拟项不显著。模型的决定系数R2=0.9951，表明酸度的实测值与预测值之间具有很好的拟合度。因此，该模型拟合程度较好，可以用此模型来分析和预测果醋工艺。在总的作用因素中差异极显著差异显著，x3、x1x3差异不显著。因此，可以用此模型对果醋工艺进行分析研究。

表6 方差分析表Table 6 Variance analysis

2.2.4.2 响应面分析 利用Design Expert软件对数据进行二次多元回归拟合，所得到的二次回归方程的响应面图如图7～图9所示，发酵温度、初始酒精度、接种量及其交互作用对响应值的影响可以从图中直观地反映出来，并确定各个因素的最佳水平。等高线形状可以反映交互作用大小，当为椭圆形时，表示交互作用显著，而圆形则表示交互作用不显著。图7中，接种量固定在零水平时，酸度随着温度和酒精度的升高而增加，达到最大值后开始降低，其等高线呈椭圆形，说明两者交互作用显著。图8中，酒精度固定在零水平时，酸度随着温度和接种量的升高而增加，达到最大值后呈下降趋势，从等高线可知温度与接种量的交互作用不显著。图9中，温度固定在零水平时，酸度随着酒精度和接种量的升高而增加，之后呈下降趋势，坡度较缓，从等高线可知其交互作用为显著。

2.2.4.3 最佳条件的确定及验证实验 通过该回归方程求解优化后的最佳工艺参数为:温度32.74℃，酒精度5.78%、接种量10.97%，此条件下酸度可达4.55%。由于要考虑实际生产，选择优化后条件为:温度32.5℃，酒精度6%、接种量11%。并且在此条件下进行验证实验，酸度达到4.54%。因此采用响应面分析方法优化得到的工艺参数较可靠。

2.3 产品质量指标

2.3.1 感官指标 色泽呈淡黄色;酸味柔和，具有百香果特有的香味;基本澄清，有微量沉淀。

2.3.2 理化指标 总酸(以醋酸计)≥4g/100mL，总糖含量≥1g/100mL。

2.3.3 微生物指标 根据《中华人民共和国酿造食醋的国家标准》，微生物指标应符合《中华人民共和国食醋卫生国家标准》，大肠菌群≤3个/100mL，致病菌(肠道菌)未检出。

图7 温度和酒精度交互影响酸度的曲面图Fig.7 Response surface showing the interactive effects of temperature and alcohol degree on acetic acid fermentation

图8 温度和接种量交互影响酸度的曲面图Fig.8 Response surface showing the interactive effects of temperature and inoculation on acetic acid fermentation

图9 酒精度和接种量交互影响酸度的曲面图Fig.9 Response surface showing the interactive effects of alcohol degree and inoculation on acetic acid fermentation

3 结论

本文通过正交实验确定了百香果醋酿造过程中酒精发酵的最佳工艺参数:发酵温度30℃，糖度14%，接种量0.15%，发酵后的酒精度可达6.2%。在酒精发酵的基础上，利用响应面分析法建立了醋酸发酵中发酵温度、初始酒精度、接种量对百香果醋含量间的回归模型，模型的决定系数R2=0.9951，表明该模型拟合程度较好，可以用此模型来分析和预测果醋工艺。醋酸发酵的最佳工艺参数:温度32.5℃，酒精度6%、接种量11%，在此条件下进行实验，发酵果醋酸度达到4.54%。

利用百香果酿制的果醋香味浓郁，含有丰富的维生素及各种人体需要的物质，随着人们生活水平的提高，市场对于果醋的需求量越来越大，百香果果醋将具有很好的开发前景。

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