草鱼盐溶蛋白乳化性的研究

杨玉玲，彭晓蓓，董 哲，2，游 远，徐红萍

(1.南京财经大学食品科学与工程学院，江苏南京210003;2.中国科学院生态环境研究中心，北京100085)

盐溶蛋白是动物肌肉中的主要蛋白质，在肉制品加工过程中承担着乳化、胶凝、溶解、吸水、吸油等多种功能，在很大程度上决定着肉制品的质量。糜类肉制品如火腿肠、哈尔滨红肠、汉堡、肉圆等都是乳状液类型产品，在这些制品中，蛋白质的乳化作用决定着产品的均匀性、水油渗出率、产品稳定性等。郭延娜等［1］研究了猪肉高盐溶蛋白-肌原纤维蛋白质的乳化性;杨万根等［2］研究了淘汰蛋鸭盐溶蛋白的乳化性和起泡性。大豆蛋白是肉制品中常见的配料之一，关于其乳化性的研究报道已有很多［3-5］。蛋白质的乳化性主要受蛋白质的来源、氨基酸组成等因素影响［6］，同时也受加工条件包括离子强度、p H、油的种类和添加量、压力、添加物(磷酸盐、非肉类蛋白)等多种因素的影响［7-8］。Richard 等［9］报道在制备肉糜时添加5%的NaCl可增加肌肉匀浆的乳化性和乳化稳定性。刘永等［10］报道了蛋清蛋白的乳化性和乳化稳定性在pH8.0时达到最大。鱼类是我国居民膳食中重要的动物蛋白来源。近年来，我国对鱼类蛋白溶解性、凝胶特性进行了部分研究，草鱼是我国鱼类中最常见的品种，每年产量在220万吨以上，居我国鱼类养殖品种的首位，是制备鱼肉产品(鱼丸、鱼糕、鱼香肠、鱼卷、模拟虾肉、模拟蟹肉等)的优良原料。董哲等［11-12］曾研究了草鱼盐溶蛋白的溶解性和凝胶特性，但目前还没有关于鱼类蛋白乳化性的研究报道。本文研究了草鱼盐溶蛋白的组成、乳化能力和乳化稳定性。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

活草鱼 市售;一级大豆油 上海嘉里粮油;次高级分子量标准蛋白(肌球蛋白重链200ku、钙调速结合蛋白130ku、兔磷酸化酶B 97.4ku、牛血清蛋白66200u、肌动蛋白43000u)Sigma公司。

DS-1高速组织捣碎机 上海标本模型;GL-20B型高速冷冻离心机 上海安亭科学仪器厂;722N可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司;DYY-8C电泳仪 北京六一仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 草鱼肉中盐溶蛋白的提取工艺 活草鱼宰杀后，取鱼背肉经洗液分散后提取盐溶蛋白，具体步骤按本实验室前期采用的方法进行［11］。

1.2.2 鱼盐溶蛋白组成的测定 采用SDS-PAGE法测定草鱼盐溶蛋白的组分，浓缩胶浓度为4%(w/w)，分离胶浓度为10%(w/w)。电泳条件为:浓缩胶电压80V，分离胶电压120V，考马斯亮蓝染色1h，脱色液脱色［13］。

1.2.3 乳化活性及乳化稳定性的测定

1.2.3.1 乳化活性的测定 根据实验设计将盐溶蛋白沉淀溶于不同的缓冲液中，使蛋白浓度为1%。添加所需体积的蛋白溶液和食用油使油和蛋白溶液总体积为20mL。用高速组织捣碎机10000r/min均质90s后，立即从底部吸取50μL乳浊液，加入0.1%(w/w)的SDS溶液5mL，混匀，在500nm下测定吸光值［9］。 乳 化 活 性 指 数 (Emulsifying Activity Index，EAI)的计算公式为:

其中，dil=100，稀释因子;A=A500，吸光度;C=0.001(g/mL)，蛋白浓度;∮=分散相体积分数。

1.2.3.2 乳化稳定性指数(Emulsifying stability index，ESI)的测定 将1.3.3.1中经均质得到的剩余乳浊液静置60min后，第二次从底部吸取50μL，用0.1%SDS溶液稀释100倍，混匀后在500nm测定吸光度。乳化稳定性指数计算公式为:

1.2.4 响应面实验设计 在 p H(4、5、6、7、8)、离子强度(0.4、0.5、0.6、0.7、0.8)、油水体积比(V油∶V水，1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8)单因素的基础上，采用响应面实验对三者进行优化。实验设计因素及水平表见表1。

表1 乳化活性和乳化稳定性响应面实验设计的因素和水平Table 1 Factors and levels for EAI and ESI with response surface method

2 结果与讨论

2.1 草鱼盐溶蛋白的组成

从草鱼盐溶蛋白的电泳图(图1)中可见，SSP中含有四条深色带和一条浅色带;通过与标准蛋白对比，得出SSP中四个主要组分的分子质量分别为200、40、30、23ku，一个次要组分为 90ku。根据动物盐溶蛋白组成的理论和标准蛋白组分可以判断出200ku是肌球蛋白重链;40ku是肌动蛋白;30ku和23ku是两条肌球蛋白轻链。陆海霞等［14］报道了秘鲁鱿鱼肌球蛋白重链的分子质量为200ku，肌动蛋白的分子质量为43ku，说明鱿鱼与草鱼的肌球蛋白重链具有相同的分子质量，而肌动蛋白分子质量存在差异。

图1 SSP的SDS-PAGE图谱Fig.1 Paragraph of SSP by SDS-PAGE

2.2 各因素对盐溶蛋白乳化性的影响

2.2.1 p H对盐溶蛋白乳化性的影响 图2为在离子强度0.5、水油体积比1∶5条件下的p H与SSP乳化活性(EAI)和乳化稳定性(ESI)的关系曲线。在pH4～5范围内，草鱼盐溶蛋白(等电点为4.6)的EAI值变化不大，在p H5处达到最小值后随p H增加逐渐增加，到p H8时EAI值达到最大值，为13.14m2/g;ESI在p H4开始随pH增加而逐渐增大，到p H6时达到最大值，为0.5137，而后逐渐下降。

图2 pH对EAI和ESI的影响Fig.2 Effect of pH on EAI and ESI

张涛等［15］报道了鹰嘴豆分离蛋白EAI在等电点附近出现最小值，而ESI在等电点附近时出现最大值;而张根生等［16］报道了大豆分离蛋白的EAI和ESI均在等电点附近时出现最小值。说明草鱼SSP的EAI随pH变化趋势与前两种蛋白质的EAI变化趋势一致，在等电点附近出现最小值。这三种蛋白质共同的特点是在等电点处溶解度最低。但草鱼ESI在pH为6时达到最大值，比较前两种蛋白质的ESI变化情况，可以得出蛋白质的ESI变化规律主要受蛋白质来源控制，与等电点关系比较复杂。

2.2.2 离子强度对盐溶蛋白乳化性的影响 图3为在p H6、水油体积比1∶5条件下的离子强度与SSP乳化活性和乳化稳定性的关系曲线。图3表明，盐溶蛋白的EAI值在离子强度0.4～0.5之间变化不大，从0.5开始逐渐增加，到0.6时达到最大值11.60m2/g，而后逐渐下降。ESI值在离子强度0.4处为最大值0.83，之后随着离子强度的增加而逐渐下降，到0.7时ESI又呈上升趋势。

图3 离子强度对EAI和ESI的影响Fig.3 Effect of ionic strength on EAIand ESI

Mu等［6］报道了红薯蛋白离子强度对EAI值和ESI值的影响与pH有关，在pH＜4时，红薯蛋白在离子强度为1.0的NaCl溶液中的EAI值比离子强度为0的溶液中的EAI值高，而当pH＞4时，后者的EAI值高于前者;在pH为4.0时，离子强度0.1的红薯蛋白ESI值等于离子强度为0时的ESI值。在其他pH下，离子强度0.1的红薯蛋白ESI值基本上低于离子强度为0时的ESI值。Zhang等［17］报道了鹰嘴豆分离蛋白的EAI在离子强度为0.1时为最小值，而后在0.1～1.0范围内随离子强度增加而增加。由此可见，离子强度对蛋白质EAI和ESI的影响不仅受其自身大小的影响，还与实验时的pH有很大关系，并且因蛋白质来源不同而不同。

2.2.3 油水体积比对盐溶蛋白乳化性的影响 图4为在pH6、离子强度0.6时，水油体积比与SSP乳化活性和乳化稳定性的关系曲线。图4显示，油水体积比为1∶4时，盐溶蛋白的EAI值最小，而后随着油水体积比的增加EAI值逐渐增加。这可能是因为高油相体积比降低了SSP的表面张力，阻止了脂肪球的聚集，从而提高了乳化液的稳定性［18］，而蛋白质乳化活性的提高和降低油水界面张力的能力与它们的表面疏水性存在一定的正相关［19］。ESI值在油水体积比为1∶5时达到最大值。

图4 油水体积比对EAI和ESI的影响Fig.4 Effect of the ratio of oil to water volume on EAIand ESI

2.2.4 各因素对乳化性的综合影响 按表1设计研究各因素对乳化活性和乳化稳定性的影响，结果见表2。

对表2中的EAI结果进行方差分析和回归分析得表3和以下方程:

EAI=22.24+4.44A+2.97B+1.55C-0.012AB+2.05AC+2.92BC。其中，R2=0.9473;CV(%)=6.24。

表2 响应面实验分析结果Table 2 Results of response surfacemethod

从表3可见，pH和离子强度是影响EAI指标的极显著因素，而油水体积比为非显著因素。

方程的R2和CV(%)值表明方程拟合较好，实验操作可信。对方程求偏导获得EAI的最大值为46.39m2/g。此时各因素的条件为:pH7.94，离子强度0.71，油水体积比1∶6.93。并对其做验证实验，考虑实际因素选取条件pH7.94，离子强度0.7，油水体积比1∶7做三组平行实验的平均值，得出EAI值为45.78m2/g，接近预测值。

表3 EAI的响应面二次模型方差分析Table 3 Square analysis of EAI

对表2中的ESI结果进行方差分析和回归分析时得表4和以下方程:

ESI=0.74+0.065A-0.054B+0.016C+0.012AB-0.017AC+0.065BC-0.14A2-0.066B2-0.024C2。其中，R2=0.9254，CV(%)=2.24。

由表4可见，一次项的三因素中pH是影响ESI值的显著因素，二次项中仅pH为极显著因素。

对方程求偏导，得出ESI最大值为0.812。此时各因素的条件为pH为7.32，离子强度0.58，油水体积比1∶5.17。此时以各因素的条件:pH7.32，离子强度0.58，油水体积比1∶5做验证实验，三次取平均值得ESI值，为0.784m2/g比预测值略低，但高于响应面实验中20个实验值。

表4 ESI响应面二次模型方差分析结果Table 4 Square analysis of response surface method for ESI

鉴于p H显著影响EAI和ESI;离子强度极显著影响EAI，因此做pH和离子强度对SSP乳化性影响的三维图，结果见图5。由图可见，EAI值随pH和离子强度增加而显著增加;SEI值先随pH和离子强度增加而增加，在pH7.5，离子强度0.6时达最大值，而后随pH和离子强度增加而降低。

图5 pH和离子强度对SSP的乳化性影响模型Fig.5 Effect of pH and ionic strength on EAI of SSP

对乳状液而言，既要有良好的乳化能力EA1，又要有良好的乳化稳定性ESI。因此，同时考虑p H和离子强度对盐溶蛋白乳化能力和乳化稳定性时，二者的最佳条件为pH 7.5、离子强度0.6。由于油水体积比对EA1和ESI均不显著，考虑原料价格因素，取EA1取得最大值时的1∶7作为最佳值。在此条件下，EAI值为28.4m2/g，ESI值为 0.74。

3 结论

SSP中肌球蛋白的重链、两条轻链和肌动蛋白的分子质量分别为200、30、23、40ku。pH 和离子强度是影响SSP乳化能力的极显著因素;但仅p H是影响乳化稳定性的显著因素。SSP乳化活性指数的最大值为45.78m2/g;乳化稳定指数的最大值为0.812。综合分析乳化特性指标，草鱼盐溶蛋白乳化性的最佳条件为:p H7.5，离子强度0.6，油水相体积比为1∶7。

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