牛奶中酵母β-葡聚糖的应用与测定

付俊鹤，望忠福，余明华，张 彦

（安琪酵母股份有限公司，湖北宜昌 443003）

酵母β-葡聚糖（见图1）是酵母细胞壁的主要成分之一，分子量从几万到几十万不等[1]，分子主链以β-1，3糖苷键结合，支链以β-1，6糖苷键结合，这种独特的三重超微螺旋结构是免疫活性最强、且最易被人体吸收的葡聚糖形式[2-3]。大量研究证明，酵母β-葡聚糖具有增强免疫功能[4-5]、抗辐射[6-7]与降血脂功能[8-9]。酵母β-葡聚糖已获得美国FDA的GRAS（Generally Regarded As Safe）认证，中华人民共和国卫生部也于2010年通过第9号公告，批准了酵母β-葡聚糖作为新资源食品，这使得酵母β-葡聚糖在食品行业有了更为广泛的应用前景。目前酵母β-葡聚糖的测定方法多采用苯酚-硫酸法测定[10]，但该法精密度较差，并且不适合检测牛奶中的酵母β-葡聚糖。本实验在牛奶中添加了酵母β-葡聚糖，并对其含量进行测定，初步建立了牛奶中酵母β-葡聚糖的检测方法，该法精密度较高，重复性良好，为酵母β-葡聚糖在乳制品中的应用提供了实验基础。

图1 酵母β-1，3-D-葡聚糖分子结构Fig.1 Molecular structure of yeastβ-1，3-D-glucan

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鲜牛奶 宜昌喜旺食品有限公司；酵母β-葡聚糖 安琪酵母股份有限公司；葡萄糖 CAS：50-99-7，纯度99.5%，Sigma公司，配制成0.2g/L标准溶液待用；半乳糖 CAS：59-23-4，纯度99.5%，Sigma公司，配制成0.2g/L标准溶液待用；各种溶液 20%乙酸锌溶液，10%亚铁氰化钾溶液，37%盐酸溶液，40%氢氧化钠溶液。

D-7000高效液相色谱仪 配有示差检测器和糖柱，日本HITACHI公司；杜氏瓶 德国SCHOTT公司；BP221S电子天平 德国Sartorius公司；WH-2微型旋涡混合器 上海沪西分析仪器厂有限公司；BME100LII型实验室高剪切乳化机 启东市长江机电有限公司；YXQ.WY21.600卧式圆形压力蒸汽灭菌锅 上海华线医用核子仪器有限公司；Z326高速离心机 德国HERMLE公司。

1.2 实验方法

1.2.1 含酵母β-葡聚糖牛奶的制备 新鲜纯牛奶→加热至75～80℃→加入适量酵母β-葡聚糖→高速剪切10min→冷却。

1.2.2 葡聚糖的测定原理 牛奶中的碳水化合物主要为乳糖，几乎不含有其他的单糖或寡糖，在牛奶中，乳糖的含量约为3%。乳糖为一个半乳糖和一个葡萄糖结合的二糖，水解后分解为一个葡萄糖和一个半乳糖[11]，而乳制品中的葡聚糖在水解后生产葡萄糖[12]：

因此分别测定水解后样品中葡萄糖和半乳糖含量，葡萄糖比半乳糖多出的部分，就是葡聚糖的含量。

1.2.3 样品处理 精确称取25.0000g（精确至0.0002g）样品放入一个150mL离心管中，加入5mL 20%乙酸锌溶液和5mL 10%亚铁氰化钾溶液，于7000r/min离心10min，去掉上清液，沉淀加25mL纯水，振荡混合均匀后，于7000r/min离心10min，去掉上清液，沉淀加25mL 75%乙醇，振荡混合均匀后，于7000r/min离心10min，去掉上清液，沉淀再加25mL纯水，振荡混合均匀后，于7000r/min离心10min，去掉上清液，将沉淀转入杜氏瓶中，分别加入6.0、9.0、12.0、18.0mL盐酸（37%），加水至150mL，将瓶子放入高压灭菌锅121℃处理60min。完成后马上冷却，将溶液pH调到6～7，然后定容至200mL。使用0.45μm孔径的醋酸纤维素膜过滤备用。

1.2.4 高效液相色谱条件 色谱柱：Sugar-Pak TM 1，6.5mm×300mm（美国Waters公司）；流动相：高纯水；流速：0.5mL/min；柱温：80℃；进样量：20μL。待仪器基线平稳后再进样。

1.2.5 建立标准曲线方程 吸取葡萄糖标液1、3、5mL到10mL容量瓶中，用高纯水定容到刻度，得到葡萄糖为20、60、100mg/L的混合标样。在上述色谱条件下准确进样20μL，得到色谱峰面积和标准物质量浓度之间的回归方程。

采用同样方法制定半乳糖标准曲线方程。

1.2.6 样品分析 在同样的色谱条件下，将处理好的样品注入色谱仪中，记录各色谱峰的保留时间和峰面积。用糖标样色谱峰的保留时间定性，用糖标样色谱峰的峰面积定量，计算出样品中葡萄糖和半乳糖的质量浓度。

1.2.7 结果计算 参考文献[13]，结果计算采用如下公式：

乳品中葡聚糖含量（%）=（C葡萄糖-C半乳糖）×V×0.9×F/W×100

式中：C葡萄糖：样品水解定容后由HPLC测定得到了葡萄糖质量浓度，g/mL；C半乳糖：样品水解定容后由HPLC测定得到了半乳糖质量浓度，g/mL；V：样品水解后定容体积，mL；0.9：葡萄糖换算为葡聚糖的换算因子；F：葡聚糖水解校正因子，F=1.25；W：称量的牛奶样品质量，g。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖与半乳糖的标准曲线方程

根据1.2.5的实验方法，得到葡萄糖与半乳糖的标准曲线方程，结果如下：

葡萄糖的标准曲线方程：y=5191.8x+12876，R2=1

半乳糖的标准曲线方程：y=5772.1x+11656，R2=1

2.2 葡萄糖与半乳糖的HPLC色谱图

图2 葡萄糖与半乳糖的HPLC色谱图Fig.2 HPLCchromatogram of glucose and galactose

样品中葡萄糖与半乳糖的HPLC色谱图见图2，其中，葡萄糖的保留时间为9.37min，半乳糖的保留时间为10.31min。

2.3 不同浓度的水解用盐酸对实验结果的影响

为了考察使用不同盐酸浓度水解时对实验结果的影响，水解时，分别加入6.0、9.0、12.0、18.0mL盐酸（37%），加水至150mL，使其浓度分别为0.5、0.75、1.0、1.5mol/L。每个浓度做两个平行实验。实验结果见表1。

表1 不同浓度的水解用盐酸对实验结果的影响Table 1 Effect of hydrochloric acid at different concentrations for hydrolysis on the experimental results

实验结果显示，水解用盐酸浓度选用1.0mol/L时，样品水解较彻底，回收率大于80%，下一步将继续在水解用盐酸浓度1.0mol/L附近时开展大量重复实验，进一步确定水解用盐酸浓度。

2.4 水解用盐酸浓度的进一步确定

前期实验了0.5、0.75、1.0、1.5mol/L的盐酸浓度，初步发现：使用1.0mol/L的盐酸水解样品能获得较好的回收率。为了进一步确定水解用盐酸浓度，现开展如下细化实验：取同一批添加了酵母β-葡聚糖的牛奶，分别使用0.8、0.9、1.0、1.1、1.2mol/L的盐酸水解样品，每个样品做若干个平行。实验数据见表2。

表2 水解用盐酸浓度的进一步确定Table 2 Further determination of the hydrochloric acid concentration for hydrolysis

实验结果表明，水解用盐酸浓度使用1.0～1.2mol/L时，结果较好，盐酸浓度选用1.0mol/L最佳。

2.5 精密度实验

取适量酵母β-葡聚糖含量为0.06%的牛奶，水解用盐酸浓度为1.0mol/L，根据上述检测方法，重复检测5次，结果见表3。

表3 精密度实验Table 3 Precision test

实验结果显示，当水解用盐酸浓度为1.0mol/L时，测定结果的RSD值为4.64%，测定结果稳定性良好。

2.6 回收率实验

依据上述实验确定的最佳酸体系（1.0mol/L盐酸），取同一批牛奶（酵母β-葡聚糖含量为0.06%）作为基础样品进行回收率实验。牛奶中酵母β-葡聚糖添加量分别为0.06%的80%、100%、120%，即0.048%、0.06%、0.072%。每个添加量重复三次实验，结果见表4。

回收率实验结果显示，当水解用盐酸浓度为1.0mol/L时，平均回收率在96.39%～97.22%之间，测定结果的RSD值在2.51%～5.38%之间，测定结果稳定性良好。

表4 回收率实验Table 4 Recovery test

3 结论

本实验对牛奶中的酵母β-葡聚糖进行高温水解-HPLC检测，确定水解用盐酸的浓度选用1.0mol/L较为适宜；该测定方法的稳定性良好，回收率较高。该检测方法的建立，为酵母β-葡聚糖在奶制品中的应用提供了实验基础。下一步将继续探讨盐酸水解时间、水解温度等因素对测定结果的影响。

[1]Magnelli P，Cipollo JF，Abeijon C.A refined method for the determination of saccharomyces cerecisiae cell wall composition and beta-1，6-glucan fine structure[J].Analytical Biochemistry，2002，301（1）：136-150.

[2]Manners DJ， Masson AJ， Patterson JC.Structure of a β-（1-3）-D-glucan from yeast cell walls[J].Biochemical Journal，1973，135（1）：19-30.

[3]Li B， Allendorf DJ， Hansen R， et al.Combined yeastβglucan and antitumor monoclonal antibody therapy requires C5a-mediated neutrophil chemotaxis via regulation of decayaccelerating factor CD55[J].Cancer Research，2007，67（15）：7421-7430.

[4]Gu Y H，Takagi Y，Nakamura T，et al.Enhancement of radioprotection and anti-tumor immunity by yeast-derivedβ-Glucan in mice[J].Journal of Med Food，2005，8（2）：154-158.

[5]Kulikova TA，Zhanaeva SY，Korolenko TA，et al.Regulation of activity of cathepsins B L and D in murine lymphosarcoma model at a combined treatment with cyclophosphamide and yeast polysaccharide[J].Cancer Letters，2005，223（1）：77-83.

[6]Kogan G，Sandula J，Korolenko TA，et al.Increased efficiency of Lewis lung carcinoma chemotherapy with a macrophage stimulator-yeast carboxymethyl glucan[J].International Immunopharmacol，2002（2）：775-781.

[7]Nicolosi R，Bell S J，Bistrian B R，et al.Changes in plasma lipids from a yeast-derived-glucan fiber in hypercholesterolemic patients[J].Submitted to Am JClin Nutr，1998，34：189-203.

[8]Kiran MD，Bhalchandra KV，Rekha SS，et al.Use of an artificial neural network in modeling yeast biomass and yield of yeastβglucan[J].Process Biochemistry，2005，40：1617-1626.

[9]Nancy DT，Leslie AB，John F，et al.Opportunitiesfor nutritional amelioration of radiation induced cellular damage[J].Nutrition，2002，18（10）：905-912.

[10]Kiran M D，Bhalchandra K V，Rekha S S，et al.Use of an artificial neural netword in modeling yeast biomass and yield of glucan[J].Process Biochemistry，2005，40：1617-1626.

[11]郭本恒.现代乳品加工技术丛书一液态奶[M].北京：化学工业出版社，2004：5-6.

[12]张海波，戴军.酵母葡聚糖分子结构分析[J].食品与发酵科技，2011，47（5）：31-33.

[13]陈少峰，望忠福.高效液相色谱法测定酵母β-葡聚糖[J].食品科技，2009（7）：278-280.