乳制品中β-内酰胺酶快速检测方法的研究

刘 芳，李传礼，何永盛，张毅杰，杨 平

（深圳市计量质量检测研究院，广东深圳518131）

抗生素残留是乳品行业面临的一个重要安全问题[1-3]。以青霉素为代表的β-内酰胺类抗生素可用于治疗牛乳房炎和其他细菌感染性疾病[4]，然而过度使用或滥用会导致其通过乳牛机体的血液残留于牛奶中。我国对生鲜乳中抗生素的含量作出了严格规定[5]，然而部分不法商贩和奶农把β-内酰胺酶加入到牛奶中，掩盖其抗生素残留超标的事实，这可能会使消费者对青霉素等抗生素类药物耐药性增高[6]。为了保障人民群众身体健康，有必要建立快速有效的方法来检测乳制品中的β-内酰胺酶。研究者已建立了多种方法检测乳制品中的β-内酰胺酶[7-10]，但这些方法均存在着一定的不足。碘量法的灵敏度和重现性较差；酸测定法存在假阳性和假阴性的问题；液相色谱法的样品前处理步骤繁琐，检测仪器昂贵；微生物法的检测周期较长。与之相比，利用试剂盒建立的快速检测方法不需要经过复杂的样品前处理，操作简便，结果精确而且直观易懂[11]，因此也越来越多地被应用到β-内酰胺酶的检测当中。目前对β-内酰胺酶检测的研究多集中在以一种或两种检测方法对某一类乳制品中的β-内酰胺酶进行检测，为β-内酰胺酶在不同种类乳制品中建立相应的检测方法并分别确定其最低检出限的报道尚不多见。Charm试剂盒法作为一种免疫分析方法，利用β-内酰胺酶可分解β-内酰胺类抗生素的原理，通过配体-受体识别法快速检测与β-内酰胺酶反应后残留的青霉素的含量，从而可以间接检测样品中是否含有β-内酰胺酶。本研究尝试利用Charm试剂盒建立一种快速检测方法，测定β-内酰胺酶在不同种类乳制品中的最低检出限，并以杯碟法作为比较，利用这两种方法进行样品的检测，为建立不同种类乳制品中β-内酰胺酶的检测方法提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

藤黄微球菌（Micrococcus luteus） CMCC（B）28001，购自中国医学细菌保藏管理中心；β-内酰胺酶标准品（0.54U/mg）、青霉素G标准品 sigma公司；舒巴坦 Fluorochem公司；抗生素鉴定培养基Ⅱ 北京陆桥技术有限责任公司；牛津杯 深圳新拓扑生物科技有限公司；Charm试剂盒、孵育器和读数仪 北京博欧实德生物技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品的前处理 液态奶样品可直接使用；酸奶样品用磷酸盐缓冲液（p H7.4）按1∶4（v/v）的比例进行稀释；奶粉和奶酪样品用磷酸盐缓冲液（pH7.4）按1∶7（m/v）的比例进行稀释。

1.2.2 快速检测法测定乳制品中β-内酰胺酶最低检出限 准确称取一定量的β-内酰胺酶标准品，以前处理后的乳制品为溶剂，配制成浓度为1.0×10-4～1.0×10-3U/mL的加标样液，从不同浓度的加标样液中取出300μL至1.5mL离心管，加入60μL青霉素阳性质控液，配成待检溶液，室温下反应3min。用移液枪取出300μL待检溶液，滴加至检测条的凹槽中，56℃孵育8min，取出后3min内判读结果。根据加标样液的检测结果确定每个样品在快速检测法中的β-内酰胺酶检出限，以每类乳制品中检出限的最大值作为该类乳制品在快速检测法中的β-内酰胺酶最低检出限。

1.2.3 杯碟法测定乳制品中β-内酰胺酶最低检出限

准确称取一定量的β-内酰胺酶标准品，配制浓度为1.5×10-3U/mL的β-内酰胺酶标准溶液，同时以前处理后的乳制品为溶剂，配制浓度为1.0×10-5～5.0×10-5U/mL的加标样液，参照《乳及乳制品中舒巴坦敏感β-内酰胺酶类药物检验方法——杯碟法》进行检测和结果判定。根据加标样液的检测结果确定每个样品在杯碟法中的β-内酰胺酶检出限，以每类乳制品中检出限的最大值作为该类乳制品在杯碟法中的β-内酰胺酶最低检出限。

1.2.4 样品中β-内酰胺酶的检测 从市场上购买不同品牌的液态奶、酸奶、奶粉、奶酪等乳制品以及原料奶作为样品，分别用快速检测法和杯碟法进行检测，以此比较两种方法的β-内酰胺酶检出率。

1.2.5 β-内酰胺酶的耐热性和耐久性实验 以液态奶为溶剂配制浓度范围为8.0×10-5～5.0×10-4U/mL的β-内酰胺酶加标样液，于室温下放置一周，期间每天均用快速检测法对不同浓度加标样液中β-内酰胺酶的残留活性进行检测。另外，配制浓度范围为8.0×10-5～8.0×10-4U/mL的β-内酰胺酶加标样液，模拟巴氏杀菌（65℃ 30min或75℃ 15s）以及保持灭菌（115℃10min）的条件，对加标样液进行加热处理，用快速检测法检测β-内酰胺酶的残留活性，研究这些处理方式对β-内酰胺酶活性的影响。

2 结果与分析

2.1 快速检测法中β-内酰胺酶最低检出限的测定

选取液态奶、酸奶、奶粉和奶酪各10种产品进行快速检测法的加标实验。加标乳制品中β-内酰胺酶的浓度控制在1.0×10-4～1.0×10-3U/mL之间，以每类乳制品中β-内酰胺酶检出限的最大值作为该类乳制品在快速检测法中的最低检出限。表1的检测结果显示，液态奶中β-内酰胺酶的检出限最低，而其他乳制品由于在前处理中以磷酸盐缓冲液按一定的比例进行了稀释，所以折算后的β-内酰胺酶检出限均比液态奶高。

表1 不同乳制品在快速检测法中的β-内酰胺酶最低检出限Table 1 Detection limit ofβ-lactamase in different dairy product base on Charm detection method

2.2 杯碟法中β-内酰胺酶最低检出限的测定

同样选取液态奶、酸奶、奶粉和奶酪各10种样品进行杯碟法的加标实验。加标乳制品中β-内酰胺酶的浓度控制在1.0×10-5～5.0×10-5U/mL之间，实验的结果如表2所示。与快速检测法得出的结果类似，液态奶样品中β-内酰胺酶的检出限低于其他三类乳制品，而在杯碟法中每类乳制品测得的β-内酰胺酶最低检出限都要低于快速检测法中对应的测定值。

表2 不同乳制品在杯碟法中的β-内酰胺酶最低检出限Table 2 Detection limit ofβ-lactamase in different dairy product based on cylinder plate method

2.3 两种方法对样品的检测

从市场上购买不同品牌的液态奶、酸奶、奶粉、奶酪样品以及数批原料奶，运用快速检测法和杯碟法分别对这些样品进行检测。表3的检测结果显示，液态奶、酸奶、奶粉和奶酪样品均未检出β-内酰胺酶，而50个原料奶样品中有一个检出β-内酰胺酶呈阳性，两种检测方法得出的结果完全一致，说明两种方法均能满足实际样品检测的需要。

2.4 β-内酰胺酶的耐久性实验

用液态奶配制浓度范围为8.0×10-5～5.0×10-4U/mL的β-内酰胺酶加标样液，于室温下放置一周，期间每隔24h用快速检测法对不同浓度加标样液中β-内酰胺酶的残留活性进行检测。从表4的检测结果可以看出，加标样液放置2d后其β-内酰胺酶活性有所下降，最低检出限由1.0×10-4U/mL提高至2.0×10-4U/mL，但随后放置至第7d为止，其最低检出限仍与放置2d后的检测结果相同，而有研究报道[12]也显示β-内酰胺酶放置4d后仍具有很强的抗生素降解能力，这表明存放时间对β-内酰胺酶活性的影响并不大。

表3 快速检测法和杯碟法对样品的检测结果Table 3 Detection results of dairy products by Charm detection method and cylinder plate method

表4 放置时间对β-内酰胺酶活性的影响Table 4 Influence of storage time to the enzymatic activity ofβ-lactamase

2.5 β-内酰胺酶的耐热性实验

用液态奶配制浓度范围为8.0×10-5～8.0×10-4U/mL的β-内酰胺酶加标样液，模拟巴氏杀菌和保持灭菌的条件对加标样液进行加热处理，研究这些处理对β-内酰胺酶活性的影响，试验的结果如表5所示。75℃加热处理15s的巴氏杀菌方式并没有对加标样液中β-内酰胺酶的活性造成影响，而另外一种巴氏杀菌方式（65℃ 30min）则使β-内酰胺酶的活性有所降低，导致加标样液中β-内酰胺酶的最低检出限由原来的1.0×10-4U/mL提高至4.0×10-4U/mL，这与Korycka等[13]的研究结果相吻合。保持灭菌（115℃，10min）的处理方式对β-内酰胺酶的活性影响最大，经过这种处理后，即使加标样液中β-内酰胺酶的浓度高达8.0×10-4U/mL时也不能被检测出含有β-内酰胺酶。

表5 加热处理对β-内酰胺酶活性的影响Table 5 Influence of heating treatment to the enzymatic activity ofβ-lactamase

3 结论

3.1 本研究利用快速检测法和杯碟法分别测定了不同乳制品中β-内酰胺酶的最低检出限。不同乳制品中β-内酰胺酶在快速检测法中的检出限为1.5×10-4～1.6×10-3U/mL（U/g），在杯碟法中则为2.0×10-5～1.6×10-4U/mL（U/g），两种方法对β-内酰胺酶的最低检出限均能满足样品检测的需要，两者在样品检测中的β-内酰胺酶检出率也相同。

3.2 快速检测法操作简单，节省时间，无需大型设备仪器，对β-内酰胺酶检测的灵敏度和准确性均与杯碟法相当，因此很适合在基层单位中作为检测β-内酰胺酶的主要手段。杯碟法对β-内酰胺酶的检出限虽然比快速检测法稍低，但其耗时长，操作复杂，对试验的要求严格，较难满足快速检测乳制品中β-内酰胺酶的需要，可以作为快速检测法检测结果的确证方法。

3.3 β-内酰胺酶的耐久性和耐热性实验表明，乳制品的存放时间对β-内酰胺酶的活性影响不大，但加热杀菌工艺则较为明显地降低了β-内酰胺酶的活性，可能会降低β-内酰胺酶在乳制品中的检出率。由此可见，为了杜绝β-内酰胺酶在乳制品中的非法添加使用，应从原料奶的质量安全进行监控，从而保障人民群众喝上放心奶。

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