羊肚菌菌丝体液体培养富锌条件的优化

王 艳，冮 洁，金李玲，沈 冰，田朝杰，王 婷，闫卉新

(大连民族学院生命科学学院，辽宁大连116600)

羊肚菌(Morchella esculenta)隶属子囊菌亚门(Ascomycotina)、盘 菌 纲 (Discomycetes)、盘 菌 目(Pezizales)、羊肚菌科(Morchellaceae)、羊肚菌属(Morchella)，因其菌盖表面呈许多小凹坑，外观极似羊肚而得名。羊肚菌是一种野生名贵食药用真菌，因其具独特的风味、丰富的营养和重要的保健作用，有着广阔的开发应用前景［1］。目前羊肚菌还不能实现商业化大规模生产，采用液体深层发酵技术培养羊肚菌菌丝体，不受环境因素的影响，易控制，效率高，价格便宜，适合工业化生产。并且深层发酵培养的真菌菌丝体与子实体在化学组成、生理功能上均很相似［2］。锌是人体必需的微量元素之一，是许多金属酶的组成成分或酶的激活剂。锌缺乏在中国人群中普遍存在，婴儿、儿童、孕妇和育龄妇女缺锌尤其严重［3］。食品中以游离态存在的锌不易被人体吸收，且一般游离态的金属均具有一定毒性。利用真菌富集功能，将无机锌与蛋白、糖等物质结合成有机锌蛋白和锌多糖等大分子活性物质，既避免了无机锌的缺点，又更有利于有机锌的免疫功能和食药用菌的抗病功能的发挥［4］。所以，利用食用菌的富锌能力，采用液体发酵技术生产富锌食用菌菌丝体可作为新型的补锌剂。毕静莹［5］、邓百万［6］、张琪林［7］、黄仁术［4］和冮洁［8］等分别对姬松茸、猪苓、大球盖菇、金针菇和真姬菇深层发酵富集锌情况进行了研究。本文首次对羊肚菌菌丝体富锌能力进行了考察，并对其液体发酵富锌的适宜条件进行了优化。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

蛹虫草(Cordyceps militaris)、大球盖菇(Strophariarugoso-annulata)、铆钉菇(Gomphidiaceae)、杏鲍菇(Pleurotus eryngii)、美味牛肝菌(Boletus edulis)、羊肚菌(Morehella esculenta)、灵芝(Ganoderma lucidum)和真姬菇(Hypsizygus marmoreus) 均购自朝阳市食用菌研究所;葡萄糖、琼脂粉、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸锌、醋酸锌、氯化锌等 以上试剂均为分析纯或化学纯;斜面和固体平板培养基(综合PDA培养基)马铃薯200g、葡萄糖20g、磷酸二氢钾1.5g、硫酸镁1.0g、琼脂粉 20g、水 1000m L，pH 自然;液体培养基 不加琼脂的综合PDA培养基。

KDB-Ⅲ微波消解炉 青岛科迪博电子科技有限公司;Z-2000火焰原子吸收光谱仪 日本日立公司;BS 223S电子精密天平 赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;GRP-9080电热恒温培养箱 上海森信实验仪器有限公司;ZHJH-C2112B无菌操作台 上海智城分析仪器制造有限公司;UV-2000紫外可见分光光度计 UNICO;HYG-3多功能摇床 金坛市杰瑞尔电器有限公司;PHS-3EpH酸度计 雷磁。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种活化 将保存菌种用接种针接入斜面培养基中，25℃恒温培养7d。

1.2.2 菌丝体培养 液体菌种培养:将活化的菌种接种在装有100m L不加琼脂的液体PDA综合培养基的250m L三角瓶中，接种量为10%，28℃，150r/min恒温振荡培养5d。菌丝体液体平板培养耐锌能力:将蛹虫草、大球盖菇、铆钉菇、杏鲍菇、美味牛肝菌、羊肚菌、灵芝、真姬菇分别接种到液体培养基和含ZnSO4为400mg/L的液体培养基中，25℃，150 r/m in振荡培养5d。

1.2.3 羊肚菌液体发酵富锌条件的优化 参照文献［8］因素水平的选择，采用四因素三水平正交实验研究装液量、接种量、pH、培养时间对羊肚菌富锌的影响。

表1 羊肚菌富锌条件正交实验因素水平表Table 1 The factors and levers of the orthogonal test for Zinc-riching conditions of Morehella esculenta

1.2.3 测定方法

1.2.3.1 菌丝体锌含量的测定 微波消解-火焰原子吸收光谱法测定［9］。微波消解:称取0.050g的粉状干菌丝于消解罐中，加入消解剂(HNO35m L)，放入微波消解炉中，中火(528W)5m in，高火(800W)8m in，微波消解后，消解罐于冷水中冷却15m in，去离子水冲洗消解罐内壁，观察消解效果，并将消解液定量转入50m L的容量瓶中，用去离子水定容，定容后吸取1.0m L溶液移入50m L容量瓶，再用去离子水定容后用于Zn浓度测定。火焰原子吸收法测定条件:工作灯电流5.0mA，光谱带宽1.3nm，负高压352V，燃气流量15000m L/min，燃烧器高度7.5mm，波长213.9nm。

1.2.3.2 菌丝体生物量的测定 取10m L发酵液于5000 r/m in离心20min，蒸馏水洗涤3次，60℃烘至恒重，分析天平称重。

1.2.3.3 富锌率的计算［10］根据公式计算富锌率:

富锌率(%)=［富锌菌丝体锌含量(μg/g)-空白菌丝体锌含量(μg/g)］×富锌菌丝体干重(g/100m L)/培养基内锌含量(μg/100m L)×100

1.2.3.4 菌丝体富锌有机化程度测定 采用持续透析法［11］。精确称取0.5g富锌菌丝体，在双蒸水中反复透析，直至用茚三铜法检验透析液中无氨基酸为止，测定菌丝体中含锌量。有机化程度指菌丝体中有机锌与总锌含量的比值。

表2 食用菌菌丝体固体平板培养耐锌能力Table 2 The capacities of Zn-resisting of the mushoom in the solid medium

2 结果与讨论

2.1 食用菌菌丝体固体培养耐锌能力的实验

由表2可以看出:大球盖菇和灵芝的富锌平板与无锌平板处理间无显著差异(p＞0.05);蛹虫草、铆钉菇、美味牛肝菌、羊肚菌、真姬菇的富锌平板与无锌平板处理间有显著差异(p＜0.05)。羊肚菌菌丝体在相同时间内生长速度最快，耐锌能力最强。

2.2 食用菌液体培养耐锌能力的实验

测定菌丝体的生物量、锌含量和富锌率，结果见表3。

表3 食用菌液体培养耐锌能力Table 3 The capacities of Zn-resisting of the mushoom in the liquid medium

通过表3食用菌液体培养耐锌能力实验结果可以看出，生物量大小顺序为:大球盖菇＞灵芝菌＞羊肚菌＞蛹虫草＞美味牛肝菌＞铆钉菇＞真姬菇＞杏鲍菇;锌含量大小顺序为:真姬菇＞铆钉菇＞杏鲍菇＞羊肚菌＞蛹虫草＞大球盖菇＞美味牛肝菌＞灵芝菌;富锌率大小顺序为:真姬菇＞铆钉菇＞羊肚菌＞蛹虫草＞大球盖菇＞美味牛肝菌＞灵芝菌＞杏鲍菇。羊肚菌液体培养生长速度快、耐锌和富锌能力较强。因此，选择羊肚菌作为食用菌富锌实验的载体。

2.3 羊肚菌富锌实验适宜锌源的筛选

分别配制 Zn(CH3COO)2、ZnSO4、ZnCl2的液体培养基，在25℃，150 r/m in条件下振荡培养5d。测定菌丝体含锌量，结果见表4。通过羊肚菌锌源筛选，富锌率的大小为:Zn(CH3COO)2＞ZnCl2＞ZnSO4。因此，选择Zn(CH3COO)2作为实验的锌源。

表4 羊肚菌锌源筛选Table 4 The screen of Zinc source of Morehella esculenta

2.4 羊肚菌富锌适宜浓度的筛选

Zn(CH3COO)2作为羊肚富锌的锌源，分别配制锌浓度为 100、200、300、400、500、600、700、800mg/L的液体培养基，在25℃，150 r/m in条件下振荡培养5d。测定菌丝体含锌量，计算富锌率，结果见表5，当锌浓度为600mg/L时，羊肚菌富锌率最高。因此，选择600mg/L作为下一步实验锌添加浓度。

表5 羊肚菌富锌浓度筛选Table 5 The screen of Zinc concentration of Morehella esculenta

2.5 羊肚菌液体发酵富锌条件的优化

由表6正交实验结果可知，以富锌率为目标值的实验因素影响的主次顺序为:A(装液量)＞C(pH)＞B(接种量)＞D(时间)，最优组合为:A1B1C2D2，即装液量 50m L、接种量 5%、pH7、培养时间4d。经对优化实验条件的验证实验表明，羊肚菌具有较强的富锌能力，富锌率可达23.20%。

2.6 富锌有机化程度的比较与分析

除去菌丝体上粘附的培养基中的醋酸锌和菌丝体中的无机锌，测定有机锌的含量，实验结果如表7所示。

从表7可看出，当在培养基中添加锌浓度为600mg/L时，羊肚菌菌丝体的总富锌率可达25.93%，但其中只有37.71%转化为有机锌，因此，羊肚菌菌丝体有机锌的富锌率为9.78%。培养基中的无机锌是通过与菌丝体中的蛋白质、多糖等大分子结合而形成有机锌的。

表6 羊肚菌富锌条件正交实验结果表Table 6 The results of orthogonal test for for Zinc-riching conditions of Morehella esculenta

表7 羊肚菌菌丝体富锌有机化程度Table 7 The degree of Zinc organic of Morehella esculenta mycelium

3 结论

矿质元素在食用菌中大部分以有机态存在，具有良好的稳定性，便于储存、运输及更好的与其他成分配伍，其中大部分与蛋白质，糖和脂肪类物质结合，有利于矿质元素的吸收和利用［12］。羊肚菌菌丝体具有较强的耐锌能力和富锌能力，优化的羊肚菌菌丝体富锌条件为:发酵温度25℃，起始pH7，振荡转速150r/min，250m L三角瓶装液50m L，锌添加量为600mg/L，接种量5%，培养时间4d。在此条件下，羊肚菌菌丝体的生物量及含锌量达最高，富锌率可达23.20%。羊肚菌菌丝体具有很强的富锌能力，猪苓菌丝体的富锌率为16.7%［6］，金针菇菌丝体的富锌量是 42.43mg/g［4］，真姬菇菌丝体富锌率为 7.98%［8］，灵芝菌丝体的含锌量高达25.09mg/g［13］。适宜羊肚菌富锌的锌源是Zn(CH3COO)2，不同的锌源对食用菌菌丝体富锌会产生不同的影响。根据黄仁术等人［4］的研究结果液体培养金针菇富锌Zn(CH3COO)2作为锌源要比 ZnSO4、ZnCl2利用率高。因为 Zn(CH3COO)2是弱酸弱碱盐，它可以使菌丝与锌在适宜的、稳定的环境中络合和生长。羊肚菌菌丝体富锌条件的研究为开发新型功能食品锌强化剂奠定了基础。

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