响应面分析优化酶法提取南瓜籽油的工艺研究

胡炜东，邹 寅

(内蒙古农业大学职业技术学院，内蒙古包头014109)

南瓜籽又称白瓜籽、金瓜籽，是葫芦科植物南瓜的成熟种子，含有丰富的必需脂肪酸、氨基酸、植物甾醇、蛋白质、维生素和多糖等，营养非常丰富，在我国种植范围广、种类多，资源丰富，极具开发价值。南瓜籽同时也是具有广阔开发应用前景的营养保健油源。南瓜籽中油脂含量较高，可占干质量的35%～50%，其中亚油酸38.60%、油酸28.63%、棕榈酸16.55%、硬脂酸8.42%。南瓜籽油不仅能明显降低血清胆固醇和甘油三酯，而且还能驱除寄生虫和防止前列腺疾病［1-2］。目前，南瓜籽油的提取方法有索氏提取法［3］、超临界流体萃取法［4］、压榨法［5］、酶法［6］和超声波法［7］。由于酶的反应条件温和，既可以保持油的有效成分，获得优质的南瓜籽油，又可以保持蛋白质和其他成分的性质，使其进一步被加工利用［8］。本研究采用酶法提取南瓜籽油，以用酶量、反应时间、反应温度与提取率为指标，在单因素实验的基础上，利用Box-Benhnken的中心组合设计原理及响应面分析法，确定最佳提油工艺参数。为南瓜籽油的提取提供新的有效途径，为生产实践进一步服务。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

南瓜籽 内蒙古河套地区籽用裸壳南瓜籽(水分含量5.7%，蛋白35.64%，纤维含量14.32%，可溶性还原糖35.63mg/100g);纤维素酶(活力为35000U/g)上海锐谷生物有限公司;所用试剂均为分析纯 内蒙鸿日公司。

TCL-16GB高速台式离心机 上海安亭科学仪器厂;LK-600B万能粉碎机 上海新诺仪器设备有限公司;索氏提取器 上海鲁硕实业有限公司;RE-52A旋转蒸发仪 上海亚荣生化厂;JA2003电子天平 上海民桥精密科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 南瓜籽油含量的测定［9］采用索氏提取法(GB/T5009.6-2003)。

1.2.2 纤维素酶辅助提取南瓜籽油的工艺［10-11］

南瓜籽→预处理→粉碎→称量→酶解→有机溶剂萃取→离心分离→真空旋转蒸发→粗油→恒重→称量

1.2.3 纤维素酶辅助提取南瓜籽油实验步骤 将南瓜籽从瓜囊中摘出，洗净后，烘干至恒重，粉碎，过60目筛，准确称取50g，按固液比1∶4加入柠檬酸缓冲液，调节pH4.8，水浴5min，加入纤维素酶，搅拌，酶解后加入石油醚提取30min，作用完毕以8000r/min离心30min，对油相进行旋转蒸发，所得粗油干燥称重，计算提取率，4℃保存。

1.2.4 单因素实验 通过单因素实验，确定p H在4.6～5.0范围内南瓜籽油的提取率达到最大，而在此范围内pH对南瓜籽油提取率的影响差异非常小，因此选用纤维素酶的最适pH4.8为宜;当固液比(物料∶柠檬酸缓冲液)达1∶4时，增加固液比对南瓜籽油的提取率增加缓慢，从工艺角度考虑，按固液比1∶4加入柠檬酸缓冲液最佳。进一步选取对酶法提油工艺有显著影响的三个因素，即用酶量、酶解时间和酶解温度，按照上述方法对南瓜籽油进行提取实验，并计算提取率。

1.2.5 纤维素酶辅助提取南瓜籽油实验设计 在单因素实验结果的基础上，利用Box-Benhnken的中心组合设计原理，三个主要因素用酶量(mg/g)、酶解时间(h)、酶解温度(℃)，分别用 X1、X2、X3来表示，每一个自变量的低、中、高实验水平分别以-1、0、+1进行编码，实验因素与水平设计见表1。

表1 响应面分析实验因素水平与编码表Table 1 Factors and levels of response surface experiments

1.2.6 南瓜籽油提油率计算

式中:W提取油为提取出南瓜籽油的质量;W原料为南瓜籽粉末的质量;α为南瓜籽含油率。

2 结果与分析

2.1 索氏提取法测定南瓜籽含油量

重复3次索氏提取实验，测得南瓜籽油含量为43.05%。南瓜籽含油量显著大于玉米胚芽油和大豆油［12］。

2.2 单因素实验结果与分析

2.2.1 用酶量对提取效果的影响 固定反应温度45℃，反应时间 2h，设定用酶量 5、10、15、20、25mg/g，考察用酶量对南瓜籽油得率的影响。得到用酶量与南瓜籽油提取率的关系如图1所示。

图1 用酶量对南瓜籽油提取率的影响Fig.1 Effect of cellulose concentration on pumpkin seed oil extraction rate

由图1可知，随着酶浓度的增加，南瓜籽油的提取率也在逐渐增大，当加酶量大于15mg/g时，油提取率趋于稳定，考虑到酶的成本及油的提取效果，宜将酶的添加量确定为15mg/g。

2.2.2 反应时间对提取效果的影响 固定用酶量为10mg/g，反应温度45℃，设定酶解时间 1、1.5、2、2.5、3、3.5h，考察时间对南瓜籽油得率的影响。得到酶解时间与南瓜籽油提取率的关系如图2所示。

图2 酶解时间对南瓜籽油提取率的影响Fig.2 Effect of hydrolysis time on pumpkin seed oil extraction rate

由图2可知，随着酶解时间的延长，南瓜籽油提取率也随之增加，当酶解时间超过2.5h后提取率略有下降，考虑到实际生产需要，酶解时间以2.5h为宜。

2.2.3 反应温度对提取效果的影响 固定用酶量为10mg/g，反应时间 2h，设定酶解温度 35、40、45、50、55、60℃，考察温度对南瓜籽油得率的影响。得到酶解温度与南瓜籽油提取率的关系如图3所示。

图3 酶解温度对南瓜籽油提取率的影响Fig.3 Effect of hydrolysis temperature on pumpkin seed oil extraction rate

由图3可知，酶解温度达45℃时南瓜籽油提取率最高为80.54%，但在40～50℃范围内提取率差异不大，在实际生产中，可根据实际生产条件选择45℃左右温度为宜。

2.3 响应面实验结果分析

2.3.1 实验结果 Box-Benhnken三因素三水平实验所得南瓜籽油提取率见表2，模型共设15个实验，其中1～12号实验为析因实验，13～15号为中心实验。析因实验构成三维定点，中心实验为区域的中心，重复三次中心实验以估计误差。

2.3.2 模型建立 利用Design-Expert 8.0.6软件对实验结果进行多元拟合，得到用酶量(X1)、酶解时间(X2)、酶解温度(X3)二次多项回归方程:Y=88.96667+2.48000X1+0.88375X2+2.19375X3+1.80500X1X2+ 0.05500X1X3+ 0.92750X2X3-4.30708X12-3.35458X22-3.87958X32

2.3.3 方差分析 利用Design-Expert 8.0.6软件对实验结果进行多元回归分析，结果见表3，方差分析表明，以南瓜籽油提取率为响应值建立的回归模型是显著的，而误差项不显著，说明回归方程与实际情况吻合度较好，确定系数 R2=98.91%，R2Adj=96.94%。因此，可用该模型回归方程代替真实实验点对实验结果进行分析。而且模型中一次项、二次项的影响是显著的，表明各因素对油提取率的影响是非线性关系。影响南瓜籽提取率的因素按主次顺序排列:用酶量(X1)＞酶解温度(X3)＞酶解时间(X2)。

2.3.4 响应面分析 根据回归分析结果做出相应的响应面分析图，由图4～图6可以看出存在极值的地方应该在等值线图的圆心，用酶量(X1)对南瓜籽油提取率影响最大，表现为曲线较陡;酶解温度(X3)、酶解时间(X2)次之，表现为曲线较平滑，随其数值的变化，响应值变化较小，从图5可以看出，响应面曲线较陡，说明用酶量(X1)和酶解温度(X3)对南瓜籽油提取率的影响较明显，这与方差分析的结果相一致。由图4～图6中等高线的形状可以反映出交互效应的强弱，椭圆形表示两因素交互作用显著，而圆形表示相反，图4等高线可以看出，用酶量(X1)与酶解时间(X2)交互作用对南瓜籽油的提取率影响显著，表现为等高线呈椭圆形，酶解时间(X2)和酶解温度(X3)交互作用次之，由图5可知，用酶量(X1)与酶解温度(X3)之间交互作用最小，表现为响应面曲线间差异小，等高线最接近于圆形。

表3 回归分析结果Table 3 Analysis results of regression and variance

图4 用酶量与酶解时间对南瓜籽油提取率影响的响应曲面图Fig.4 Response surface of cellulose concentration and hydrolysis time on the extraction rate of oil

为了确定各因素的最优值，利用软件分析得X1、X2、X3的最大代码值 0.346、0.269 和 0.317，换算得出实际值为用酶量(X1)16.73mg/g，酶解时间(X2)为2.6345h，酶解温度(X3)为46.585℃，理论提取率为89.86%。

2.3.5 回归模型的验证实验 为检验响应面分析所得结果的可靠性，采用上述优化条件进行提取南瓜籽油实验，考虑到实际操作，将提取条件修正为用酶量17mg/g，酶解时间为2.64h，酶解温度为47℃，在此条件下提取3次，南瓜籽油平均提取率89.12%，实验值与理论值的相对误差为0.82%。由此可见该模型很好的反映了酶法提取南瓜籽油的条件，证明利用响应面法确立酶法提取南瓜籽油的工艺参数是可行的。

图5 用酶量与酶解温度对南瓜籽油提取率影响的响应曲面图Fig.5 Response surface of cellulose concentration and hydrolysis temperature on the extraction rate of oil

图6 酶解时间与酶解温度对南瓜籽油提取率影响的响应曲面图Fig.6 Response surface of hydrolysis time and hydrolysis temperature on the extraction rate of oil

3 结论

利用辅助酶法提取南瓜籽油，具有高效、温和、经济等特点，同时采用Box-Benhnken中心组合设计原理及响应面分析法，利用Design-Expert软件进行便捷、可靠的优化组合和数据分析，得出纤维素酶提取南瓜籽油的较佳工艺:用酶量17mg/g，酶解时间为2.64h，酶解温度为47℃，南瓜籽油提取率达89.12%。与理论预期值的拟合度较好。各因素主次关系为:用酶量(X1)＞酶解温度(X3)＞酶解时间(X2)。

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