响应面法优化微波辅助提取芋头多糖工艺研究

姜绍通，汪洪普，潘丽军

(合肥工业大学农产品加工研究院，合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽省农产品精深加工重点实验室，安徽合肥230009)

芋头别名为芋魁、土芝，俗称芋艿，属天南星科［1］。芋头中含有丰富的淀粉、膳食纤维、多糖、维生素和矿物质元素，不仅可食用，还具有宽肠胃、补脾胃、腹中癖块、消痨散结等作用，主治肿毒、牛皮癣、烫火伤等症［2］。早期研究报道认为其主要功效与其含有花青甙、甾醇和过氧化氢酶等活性成分有关，特别是其中丰富的多糖可能具有重要作用，已有报道芋头中含有水溶性多糖，且富含杂聚糖，但关于芋头多糖的提取没有更为详尽的资料［3］。多糖是自然界中储量丰富的生物聚合物，具有能量储存、结构支持、防御作用和抗原决定性等多方面的生物功能。而植物多糖具有特殊的生物活性，如协助消化、抗疲劳、抗病毒、抗菌消炎、抗衰老、抗辐射、抗肿瘤、降血糖、降血脂及免疫调节等。有关研究报道芋头多糖无毒安全，具有清除自由基、抗肿瘤、增强免疫力等生理功能［4-8］。而关于芋头多糖提取的方法局限于传统的水提法，该法提取时间长，提取率低［9］。微波技术是近几年来用于天然植物有效成分提取的一项新技术，与传统的萃取方法如水法提取、回流提取、有机溶剂萃取等方法比较，微波萃取技术具有快速、高效、安全、有效成分提取率高、节能等特点［10-13］。本论文引入微波技术辅助水浴法提取芋头多糖，并对此方法芋头多糖的提取工艺进行优化研究，旨在为进一步开发利用芋头资源提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

芋头 购于家乐福;苯酚、浓硫酸、无水乙醇、95%乙醇、无水乙醚、丙酮、三氯甲烷、正丁醇、葡萄糖 均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司。

NJL07-3型实验用微波炉 南京杰全仪器有限公司;UV-2102PC型可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司;R-201旋转蒸发器 上海申胜生物技术有限公司;HH-2数显恒温水浴锅 国华电器有限公司;HC-3018R型高速冷冻离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司;DHG-9240A电热恒温鼓风干燥箱 上海培因实验仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 芋头多糖微波提取工艺 原料预处理:新鲜芋头→清洗、去皮、切块→65℃烘干至恒重→粉碎过40目筛→芋头干粉，待用。

工艺流程:称取定量芋头粉末→微波辅助热水浴浸提→提取液离心(6000r/min，20min)→滤渣→二次提取→合并滤液→酶解去淀粉(先按照20U/g加入液化酶，75℃，pH6.0酶解1.5h，I2/KI检至无淀粉后再按照200U/g加入糖化酶，60℃，pH6.5酶解1.5h)→95%的乙醇沉淀→无水乙醇淋洗→沉淀复溶→透析(分子量3500，透析36h)→真空浓缩→粗多糖浓缩液→稀释测多糖。

1.2.2 芋头多糖的测定 多糖的测定采用苯酚-硫酸法［14］。取2mL提取液，分别加入1mL的6%的苯酚和5mL的浓硫酸，沸水浴5min后立即冷却，在波长495nm下测定吸光度。以葡萄糖含量为横坐标，依葡萄糖标准曲线的回归方程Y=13.0643X+0.0065(R2=0.9997)计算芋头粗多糖的含量。

1.2.3 芋头多糖提取率的测定 芋头多糖的提取率(%)=芋头多糖质量/芋头干粉质量×100

1.2.4 微波辅助提取芋头多糖单因素实验 准确称取 5g 芋头干粉，在不同的液料比(10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1)，不同的微波功率(200、300、400、500、600、700W)，不同的微波处理时间(40、60、80、100、120s)，不同的水提温度(50、60、70、80、90℃)，不同的水提时间(1、2、3、4、5、6h)，不同的提取次数(1、2、3、4次)等条件下考察各个因素对芋头多糖提取率的影响。所有实验均为一式3份，取平均值。

1.2.5 响应面实验设计 在单因素实验的基础上，选择较佳的液料比和提取次数。采用Box-Behnken中心组合实验设计对影响芋头多糖得率的四个主要因素微波功率、微波处理时间、水提温度和水提时间进行优化［15-16］。实验因素与水平设计见表1。

表1 实验因素水平及编码Table 1 Variables and levels in Box-Benhnken experimental design

1.2.6 数据处理方法 利用Design-Expert 8.05软件进行实验设计和分析。实验数据以平均数±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 液料比对多糖提取率的影响

不同液料比对多糖提取率的影响结果见图1。

图1 液料比对多糖提取率的影响Fig.1 Effect of water/material ratio on polysaccharides yield

由图1可知，多糖的提取率随着液料比的增加不断增加，当料液比为30∶1时开始增加缓慢，因为适当的液料比可以提高多糖的溶出率，液料比过小，溶剂量少导致物料的黏度大，多糖的扩展速度慢会阻止多糖的有效溶出，提取不完全，故提取率较低［17］，而当液料比超过30∶1时，几乎所有的多糖已经全部溶出，再增加溶剂的量多糖的溶出率增加不明显，故液料比以30∶1为宜。

2.2 微波功率对多糖提取率的影响

不同的微波功率对多糖提取率的影响结果见图2。

图2 微波功率对多糖提取率的影响Fig.2 Effect of microwave power on polysaccharides yield

由图2可知，当微波功率为400W时，多糖提取率达到最高，再随着功率的增加，提取率显著下降。故微波功率选择400W为宜。因为功率太小，不足以提供足够的摩擦热使胞内水分汽化而实现微波破壁，故提取率较低，而微波功率较高，细胞内部温度上升较快，故破壁作用较大，有利于多糖的溶出［17］，但是功率过高，瞬间的升温会造成部分多糖降解，导致提取率下降。

2.3 微波处理时间对多糖提取率的影响

不同的微波处理时间对多糖提取率的影响结果见图3。

由图3可知，随着微波处理时间的增加，多糖提取率先增加后减少，当微波处理时间为80s时提取率最高，之后多糖提取率开始下降。因为微波加热时升温迅速，处理时间长时会因部分多糖分解而造成损失［18］，故微波处理时间以80s为宜。

图3 微波处理时间对多糖提取率的影响Fig.3 Effect of microwave treatment time on polysaccharides yield

2.4 水提温度对多糖提取率的影响

不同的水提温度对多糖提取率的影响结果见图4。

图4 水提温度对多糖提取率的影响Fig.4 Effect of water extraction temperature on polysaccharides yield

由图4可知，随着水提温度的升高，多糖的提取率增加明显，当温度达到80℃时多糖提取率达到最高，而后随着温度的继续升高多糖提取率又呈现降低趋势，可能是因为长时间的高温使得部分多糖降解而导致提取率降低，因此水提温度以80℃为宜。

2.5 水提时间对多糖提取率的影响

不同的水提时间对多糖提取率的影响结果见图5。

图5 水提时间对多糖提取率的影响Fig.5 Effect of water extraction time on polysaccharides yield

由图5可知，随着水提时间的增加，芋头多糖的提取率逐渐增加且3h后趋于平稳，当水提时间为3h时芋头多糖的得率增加平缓，考虑到提取效率，选择水提时间3h为宜。

2.6 提取次数对多糖提取率的影响

不同的提取次数对多糖提取率的影响结果见图6。

图6 提取次数对多糖提取率的影响Fig.6 Effect of extraction times on polysaccharides yield

由图6可知，随着多糖提取次数的增加，多糖提取率也逐渐增加，但在提取了两次之后，多糖几乎全部溶出，考虑到降低成本和提高效率，选择提取的次数为2次。

2.7 响应面优化实验结果

2.7.1 响应面实验方案与结果 在单因素实验的基础上，对水提时间、水提温度、微波时间、微波功率进行了四因素三水平响应曲面实验设计，实验设计与结果见表2。

表2 Box-Benhnken中心组合实验设计及芋头多糖提取率结果Table 2 Box-Benhnken experimental design matrix and corresponding experimental values of taro polysaccharides yield

2.7.2 回归模型的有效性及显著性分析 利用Design-Expert软件对表2数据进行二次多元回归拟合，计算得出回归模型进行方差分析和方程各项系数及方差分析(表3)。

表3 回归模型方差分析和回归方程系数显著性检验Table 3 Variance analysis of regression equation and significance test for regression coefficients

经过拟合得到多糖提取率的预测值(y)对编码自变量X1、X2、X3和X4的二次多元回归方程如下:

对上述回归模型进行方差分析(表3)，结果表明:模型高度显著(p＜0.01)，失拟检验不显著，回归模型的调整确定系数为0.9514，说明该模型能够解释95.14%的变化，因此，可用此模型对芋头多糖的提取率进行分析和预测。

从表4回归方程系数显著性检验可知:上述方程中一次项X2、X4高度显著，X3处于显著水平，且影响程度依次为X2＞X4＞X3＞X1;二次项X12、X22和X32高度显著，X42处于显著水平，交互项X1X2、X1X4和X2X3不显著，X1X3、X2X4显著，X3X4高度显著。即水提时间(X1)与微波功率(X3)的交互作用、水提温度(X2)与微波处理时间(X4)的交互作用和微波功率(X3)与微波处理时间(X4)的交互作用对实验指标影响显著。

对二次回归方程进行优化，剔除二次完全回归方程中的不显著因子 X1、X1X2、X1X4和 X2X3，得到新的二次回归方程为:

Y=-65.17858+0.96573X2+0.0779707X3+0.24748X4-1.85×10-3X1X3+1.975×10-3X2X4-2.7X3X4-0.56608X12-6.84833×10-3X22-6.52333×10-3X32-1.96083×10-3X42

RSM图形是特定的响应值Y对应自变量构成的一个三维空间图，为更直观地反映水提时间与微波功率(X1X3)、水提温度与微波处理时间(X2X4)和微波功率与微处理波时间(X3X4)三个交互作用对多糖提取率的影响规律，分别将模型中其他两个因素固定在0水平，绘制出相应的三维曲面图，如图7～图9所示。

图7直观的给出了水提时间和微波功率交互作用的响应面图，等高线沿微波功率轴变化相对密集，说明微波功率的影响比水提时间的影响大。因为微波功率大小直接影响分子的破壁，只要分子能够有效的破壁，多糖能够很快的溶出。

图7 水提时间(X1)与微波功率(X3)对多糖提取率影响的响应曲面Fig.7 Response surface showing the interactive of water extraction time(X1)and microwave power(X3)on polysaccharides yield

当水提时间为3h，微波功率为400W时，水提温度和微波处理时间对多糖提取率的影响见图8。在等高线图中可以看出水提温度轴变化相对密集，故水提温度的影响比微波处理时间的影响大。当水提温度为80℃时，处理时间在70～90s范围内，多糖提取率随着微波时间的增加呈现先增加后减小的趋势。而当微波时间一定时，水提温度在70～90℃范围内，指标逐渐增加，达到极大值后逐渐下降。

图8 水提温度(X2)和微波处理时间(X4)对多糖提取率影响的响应曲面Fig.8 Response surface showing the interactive of water extraction temperature(X2)and microwave time(X4)on polysaccharides yield

由图9的等高线的形状可以直观的看出微波功率和微波处理时间的交互作用显著。且沿着微波功率轴变化相对密集，因此微波功率的影响比微波处理时间的影响大。当微波处理时间一定时，微波功率在300～500W范围内，随着微波功率的增大，提取率逐渐增加，达到极大值后逐渐下降。但过高的微波功率和过长的微波处理时间都会造成提取液的迅速升温而导致部分多糖分解从而降低多糖的提取率。

图9 微波功率(X3)与微波处理时间(X4)对多糖提取率影响的响应曲面Fig.9 Response surface showing the interactive of microwave power(X3)and microwave time(X4)on polysaccharides yield

2.7.3 二次回归模型的验证实验 在上述实验范围内，随意选取5组数据，在对应条件下用回归方程求出回归值(或预测值)Y，再与实验值进行比较，见表4。

经过验证实验值与模型计算值，平均误差为±0.87%，证明用Design-Expert中的Box-Behnken中心组合实验设计求得多糖提取率的数学模型是可行的，该数学模型可应用于实际多糖提取工艺的分析预测。

表4 实测值与预测值的比较Table 4 Comparison between predicted and experimented results

对优化的二次回归模型进行数学分析，得到最大响应值对应的因素条件:水提时间为3.06h、水提温度为81.62℃、微波功率为394.80W、微波处理时间为77.03s，此时芋头多糖提取率的理论最大值为5.58%。考虑到实际操作的便利，将提取工艺参数修正为水提时间3h、水提温度82℃、微波功率395W、微波处理时间77s，在此条件下进行了3次平行验证实验，得到芋头多糖提取率平均值为5.57%，与理论预测值相对误差小于0.5%，说明采用RSM优化得到的多糖提取工艺条件参数准确可靠，按照建立的模型进行预测在实践中是可行的。

3 结论

本实验通过响应曲面法优化微波辅助热水浴法提取芋头中非淀粉多糖的提取工艺，采用糖化酶和液化酶结合的方法去除提取多糖时溶出的淀粉。由于这两种酶很好的专一性，且对于淀粉的酶解表现出很强的高效性，因此在保证迅速去除淀粉的同时很好的保留了非淀粉芋头多糖。而且这两种酶酶解淀粉的产物均为单一的葡萄糖，因此对于由不同单糖组成的非淀粉类的多糖的作用效果甚微。响应面实验结果表明微波处理时间、微波功率和水提温度对多糖的提取率影响均显著，各因素对芋头多糖提取率的影响顺序为水提温度＞微波处理时间＞微波功率＞水提时间。水提时间和微波功率、水提温度和微波处理时间、微波功率和微波处理时间交互作用对多糖提取率影响显著;多糖的最佳提取工艺条件为:水提时间为3h、水提温度为82℃、微波功率为395W、微波处理时间为77s，此时芋头多糖的实际平均提取率为5.57%。与理论预测值的相对误差小于0.5%。通过验证实验说明所建立的模型可很好在实践中进行预测。

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