蜂花粉总黄酮含量的品种和产地差异

胡晓岚，汤丽倩，张 翀，朱金梁，冯乾健，陈青俊，虞英民，安 然，欧菊芳

(1.杭州澳医保灵药业有限公司，浙江杭州310022;2.国家轻工业食品质量监督检测杭州站，浙江杭州310009)

蜂花粉为工蜂采集花粉，用唾液和花蜜混合后形成，包括工蜂采集而成的团粒和人工粉碎而成的粉末［1］。蜂花粉中含有丰富的营养成分，如必需氨基酸、不饱和脂肪酸、维生素、多酚类和黄酮类、多糖等活性物质。蜂花粉具有多种保健功能，能增强机体免疫力，防止动脉硬化、高血脂、高血压、静脉曲张等疾病［2］。蜂花粉的生物活性与其含有的丰富的黄酮类成分有关［3］。对蜂花粉的总黄酮含量进行检测，目前主要的方法有:电导滴定法［4］、毛细管电泳法［5］、液相色谱法［6］、比色法［7］、分光光度法［8］。本文以分光光度法测定蜂花粉中的总黄酮含量，以探索国产不同产地、不同品种蜂花粉中总黄酮含量的差别。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

在2008～2011年期间采集的79份不同产地、不同品种的蜂花粉。采集的花粉保存于-18℃的冷库中;无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠 分析纯;芦丁对照品 中国药品生物制品检定所，纯度92.5%。

UV2550紫外分光光度计 苏州岛公司;FA2004电子天平 上海电子天平厂。

1.2 黄酮测定方法

1.2.1 试液制备 精确称取蜂花粉样品1～3g(精确至0.0001g)，加70%乙醇40m L，加热回流2h提取样品中的黄酮，冷却，滤过，将滤液置于50m L容量瓶中，以70%乙醇洗涤残渣，将洗涤液并入容量瓶，用70%乙醇定容至刻度，摇匀，从中精确吸取2m L，置于10m L容量瓶，用70%乙醇稀释至刻度，摇匀，待测。

1.2.2 建立标准曲线 精密量取200μg/m L芦丁标准品使用液0、1、2、3、4、5、6m L，分别置于 25m L 容量瓶中，各加水至6.0m L，加5%亚硝酸钠溶液和10%硝酸铝溶液各1m L，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液10m L，加水至刻度，摇匀，放置15min，510nm作为测定波长，分光光度法测定标准溶液的吸光值，以吸光值为纵坐标，以标准溶液浓度为橫坐标，绘制标准曲线。

1.2.3 试液测定 精确量取按“1.2.1”所示方法制备的试液2m L，置于25m L容量瓶中，实验方法同1.2.2，将结果带入标准曲线，求得试液中的黄酮浓度。

1.2.4 分析方法的确定

1.2.4.1 波长的确定 黄酮与亚硝酸钠和硝酸铝反应形成络合物，在可见光区具有吸收峰［8］。本文按照“1.2.2”所述的方法使标准溶液显色，在400～600nm的波长范围内对溶液进行扫描。

1.2.4.2 黄酮提取方法 精确称取油菜花粉样品1～3g(精确至0.0001g)，分别采用“70%乙醇，加热回流2h”、“70%乙醇，加热回流4h”、“无水乙醇，加热回流2h”和“无水乙醇，超声30min”4种方法进行提取，加热回流的温度为90℃，超声波功率为100W，再按前述方法对提取液中的黄酮含量进行测定。

表1 黄酮的不同提取方法Table 1 Protocols for extracting of flavones

1.2.4.3 络合物稳定性 按“1.2.1”配制样品溶液，按照“1.2.3”所述的方法使溶液显色，经过 5、10、15、20、30m in的放置后分别测定溶液的吸光值。

1.2.5 方法精密度 选择油菜花蜂花粉和玉米花蜂花粉，分别对其中的黄酮含量进行测定，以6次测定结果的标准误来衡量测定方法的精密度。

1.2.6 方法回收率 选择油菜花蜂花粉，分别按本底值1.5、1.0、0.8倍的量加入芦丁标准品，每一加量重复3次，分别测定提取液中的黄酮含量，根据测定结果计算回收率。

2 结果与分析

2.1 方法学研究

2.1.1 测定波长 实验结果表明，络合反应的生成物在波长510.40nm处吸光值最大，故本实验选定510nm作为测定波长。

图1 络合物紫外扫描图Fig.1 UV scan of the conjugate

2.1.2 黄酮提取方法 从表2可以看出，不同方法对黄酮提取率高低影响顺序依次为:4＞1＞3＞2，但是“方法4”的提取液有时会含有沉淀。综合考虑，本文最终选择“方法1”作为整个实验的提取方法。

表2 与不同提取方法相对应的黄酮含量Table 2 Content of flavones extracted by different protocols

2.1.3 络合物稳定性 从表3中可以看出，络合物在15m in内较稳定，故将放置时间定为15m in。

表3 络合物稳定性实验结果Table 3 Results of the test on stability of the complex

2.1.4 标准曲线 从图2中可以看出，芦丁在0.2～1.2mg质量范围内线性关系良好，线性相关方程:y=0.525x-0.00771，R2=0.9995。

图2 芦丁标准曲线图Fig.2 Standard curve of rutin

2.1.5 精密度 6次测定的结果表明油菜花蜂花粉和玉米花蜂花粉中黄酮含量的平均值分别为2.79%和0.50%;测定精密度分别为1.53%和2.36%。

表4 精密度测定结果Table 4 Results of the precision test

2.1.6 回收率 3个添加水平共9次测试的结果显示，芦丁在油菜花蜂花粉中的添加回收率介于94.5%～98.0%，平均回收率96.7%。

2.2 样品测定

按“1.2”所述方法检测2008～2011年收集的全国79份15个品种蜂花粉样品，检测结果见表6。

表5 回收率实验结果(70%回流2h)Table 5 Results of the test on recovery

表6 不同产地、不同品种蜂花粉总黄酮含量测定结果Table 6 Results of the test on content of flavones in bee pollens of different varieties collected from different regions

续表

从表6中可以看出，在所有79个批次样品中，总黄酮含量最高的来自油菜花蜂花粉(3.49%)，含量最低的来自玉米花蜂花粉(0.49%)。

以品种为分析目标，对所有样品的总黄酮含量做差异显著性分析，发现含量最高的是油菜花蜂花粉(平均达到3.15%)，其次是玫瑰花蜂花粉和五味子花蜂花粉(平均达到2.20%和2.04%)，15个品种中总黄酮含量最低的是芝麻花蜂花粉(平均为0.52%)(表7)。

对于油菜花蜂花粉，在所涉及的6个省区内，采自青海、新疆、浙江、内蒙古、安徽5个省区的样品，其总黄酮含量无明显差异，但它们均明显高于采自甘肃省的样品(表8)。同样对于油菜花蜂花粉，在所涉及的4个年份内，2008～2010年采集的样品，其总黄酮含量无明显差异，但它们均明显高于2011年采集的样品(表9)。以上统计结果表明产地和采集年份对油菜花蜂花粉总黄酮含量有影响，但影响程度有限。

表7 不同品种蜂花粉总黄酮含量Table 7 Content of flavones in bee pollens of different varieties

表8 不同省区油菜花蜂花粉总黄酮含量Table 8 Content of flavones in bee pollens collected from cole in different provinces

表9 不同年份油菜花蜂花粉总黄酮含量Table 9 Content of flavones in bee pollens collected from cole in different years

如果不考虑品种和采集年份，总黄酮含量最高的蜂花粉是产自青海的(平均达到2.91%)，其次是产自新疆的(平均达到2.55%)，再其次是产自广东的(平均达到1.93%)，产自黑龙江和海南的蜂花粉总黄酮含量最低(两者均为0.64%)。以产地为目标，对所有样品的总黄酮含量做差异显著性分析，发现尽管差异幅度较大，但大多并无统计学意义(表10)。

3 讨论与结论

3.1 魏永生等［9］比较了索氏提取法、热回流法、冷浸法，比较了不同提取法对于蜂花粉总黄酮的提取效果。本文对热回流法和超声提取法的提取率同样做了比较。从减少有毒溶剂的使用和便于溶剂回收的角度，两种提取均用乙醇作为溶剂，研究结果表明在预设的提取流程下超声法对总黄酮的提取率并不低，甚至略高于热回流提取法，但超声法在提取时往往会产生沉淀而热回流法的提取液可以直接用于测定，结合时效性方面的考虑，本文最终确认“70%乙醇，加热回流2h”是提取的最佳选择。

表10 不同产地蜂花粉总黄酮含量Table 10 Content of flavones in bee pollens from different regions

3.2 本文对2008～2011年间采自23个的不同省份的15个品种共79个批次的国产蜂花粉中总黄酮含量进行了测定。从品种上看，总黄酮含量最高的当属油菜花蜂花粉(平均达到3.15%)。张红城等［10］和董捷等［11］分别对6个和8个品种的蜂花粉的总黄酮含量做了比较，其结果均显示油菜花蜂花粉是总黄酮含量最高的品种。在这一点上，本文的研究结果与前人完全一致。按照总黄酮含量高低，本文所涉及的15个品种的排列顺序为:油菜花＞玫瑰花≥五味子花＞杂花≥虞美人花≥向日葵花=蚕豆花≥子瓜花≥党参花≥荞麦花≥荷花≥玉米花=茶花≥南瓜≥芝麻花。同样地，按照总黄酮含量高低，张红城等［10］的6个品种的排列顺序为:油菜＞杏花＞荞麦＞茶花＞向日葵花 ＞荷花;董捷等［11］的8个品种的排列顺序为:油菜＞五味子＞杏花＞荞麦＞玫瑰＞茶花＞向日葵花＞荷花。对照本文和前人的研究结果，可以认定油菜花和五味子花的蜂花粉属于总黄酮含量较高的品种，而茶花和荷花的蜂花粉总黄酮含量往往较低。至于玫瑰花、向日葵花和荞麦花，本文的排列顺序与前人的有所不同。本文所涉及的品种相对较多，除了在前人已经比较过的油菜、玫瑰、五味子、向日葵花、荞麦花、荷花、茶花等7个品种之外，本文还对虞美人、蚕豆、子瓜、党参、玉米、南瓜、芝麻等7个品种做了比较。

3.3 本文以油菜花蜂花粉为例，分析了产地和采集年份对同一品种蜂花粉总黄酮含量的影响。从分析结果可以看出，蜂花粉的总黄酮含量在同一品种内是相对稳定，产地和年份因素对总黄酮含量检测结果均有影响，但影响程度有限。这一结论建立在2008～2011年从6省区采集的15份样品的分析上，因此具有一定的可信度。

3.4 产地因素对蜂花粉总黄酮含量究竟有无实质影响，是人们一直以来感兴趣的一个问题，如果不考虑品种和采集年份，正如表8所显示的那样，总黄酮含量尽管看似差异较大，但这种差异大多并无统计学意义，这是主要因为同一省区的蜂花粉中往往包含总黄酮含量差别较大的若干不同品种。更为精确的分析只有建立在更大样品量的基础上，因此今后须进一步加大各省区的样品采集量，这样才能有效解答上述疑问。本文通过对不同年份从全国各省区采集的不同品种的79个批次的蜂花粉样品的检测，使人们对国内市场上蜂花粉品种黄酮含量分布情况有了初步了解，为蜂花粉资源的合理开发提供了科学依据。

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