枸杞多糖对NMDA致大鼠视网膜损伤保护作用的研究

白 双，于 鑫，杜瑛培，郑 萍，2，郑 婕，2，闫 琳，2，戴贵东

(1.宁夏医科大学药学院2.宁夏回药现代化工程技术研究中心3.宁夏医药研究所;宁夏银川 750004)

枸杞多糖(lycium barbarum polysaccharide，LBP)是从宁夏特色回药材枸杞的干燥成熟果实中提取所得。已有文献报道［1－3］，枸杞多糖具有抗氧化、防衰老、抗辐射等多种生物学活性，尤其是对急性眼高压、糖尿病眼病等视网膜损伤具有保护作用。本实验旨在通过建立NMDA致大鼠视网膜损伤动物模型，研究枸杞多糖的保护作用及可能机制，为临床视网膜损伤疾病防治提供实验依据。

1 材料

1.1 动物 清洁级♂Sprague-Dawley大鼠，7～8周龄，体质量120～150 g，由宁夏医科大学实验动物中心提供，动物合格证号:SCXK(宁)2012-0006

1.2 药品与试剂 枸杞多糖购自宁夏沃福百瑞生物食品有限公司，含量≥30.0%，批号:64WFBR100501;戊巴比妥钠、NMDA、氯化钠、多聚甲醛均购自Sigma公司;凯基全蛋白提取试剂盒、凯基BCA蛋白含量检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司;兔抗大鼠eNOS、iNOS抗体购自Abcam公司;兔抗大鼠NMDAR2A抗体、兔抗β-actin抗体购自Cell Signaling公司;山羊抗兔二抗购自北京中杉金桥生物技术公司。Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrate购自Thermo Scientific公司;实验用水为超纯水。

1.3 仪器 TY96-ⅡN型超生细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司);H1850R型台式高速冷冻离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司);5 μl微量注射器(上海安亭微量进样器厂);Mutiskan Go酶标仪(美国Thermo Fisher公司);PowerPac Basic电泳仪(美国BIO-RAD公司);培清JS-860B凝胶成像分析仪(上海培清科技有限公司)。

2 方法

2.1 实验动物分组及模型的建立 56只清洁级♂Sprague-Dawley大鼠随机分为4组:NMDA组、NMDA+枸杞多糖(100、200 和400 mg·kg－1)组，每组14只大鼠。NMDA组大鼠的左眼为正常对照组。NMDA致大鼠视网膜神经元损伤模型，根据Kawasaki等采用的方法略为改进［4］，具体方法:各组大鼠腹腔注射戊巴比妥钠40 mg·kg－1麻醉，采用微量注射器大鼠右眼玻璃体内注射2 μl浓度为40 nmol·L－1的 NMDA。枸杞多糖分别按100、200和400 mg·kg－1于NMDA注射前7天灌胃给药，共14 d。模型组给予等体积生理盐水。d14处死各组大鼠。每组取5只大鼠眼球剔除玻璃体纵切后浸入4%多聚甲醛固定，其余大鼠眼球剔除玻璃体后置液氮中速冻后放－80℃冰箱中冻存。

2.2 病理学组织观察 多聚甲醛固定24 h后，用流水冲洗3 h，然后梯度乙醇脱水、常规石蜡包埋、切片和苏木精-伊红(HE)染色处理，每张切片随机选取视神经根部周围5个圆形视野，于显微镜下观察视网膜内丛状层厚度并对视网膜神经节细胞层的神经元进行计数。计数方法:同一倍率下，记录视野中神经节细胞层长为100 μm(长度以标尺为准，平行于神经节细胞层方向)的任意区域内神经元个数，取平均值。

2.3 Western blot检测 在约100 mg经液氮研磨的视网膜组织中加入0.5 ml冷裂解缓冲液，冰浴下超声破碎细胞。4℃，10 000 r·min－1离心 10 min，取上清蛋白定量，剩余上清加入上样缓冲液100℃水浴10 min，－20℃保存。取蛋白样本75 μg上样，7.5%SDS-PAGE凝胶电泳(80V/120V电压)，200 mA恒定电流转膜至硝酸纤维素膜，5%脱脂奶粉封闭1 h后，分别用抗NMDAR2A抗体(1∶200)、抗eNOS抗体(1∶200)、抗iNOS抗体(1∶200)及抗βactin抗体(内参，1∶1 000)4℃孵育过夜。加入山羊抗兔二抗(偶联有HRP，1∶4 000)常温孵育2 h，加入超级化学发光底物反应液，曝光胶片。胶片扫描结果采用Quantity-one软件分析，将目的条带的光密度值与其相对应的内参β-actin的光密度值相比以校正误差，所得比值代表该目的蛋白的相对含量。2.4统计学处理实验结果以±s表示。用SPSS 19.0软件包进行统计分析。多组间均数的比较采用One-way ANOVA分析。

Fig 1 Effect of LBP on retinal damage in NMDA treated rats

3 结果

3.1 视网膜组织学改变 光镜下正常对照组大鼠视网膜HE染色后各层组织结构清晰，完整，染色均匀，清晰可见3个核层。由内向外依次为神经节细胞层(GCL)，内核层(INL)以及外核层(ONL)。神经节细胞呈单层排列，细胞大小不一，呈圆形或椭圆形，INL及ONL细胞呈多层分布，内丛状层(IPL)位于GCL与INL之间，外丛状层(OPL)位于INL与ONL之间。NMDA组以GCL和IPL损伤最为明显，神经节细胞减少，胞内空泡样变性，核固缩浓染，IPL变薄。枸杞多糖(100、200和400 mg·kg－1)均能抑制NMDA所致神经节细胞的凋亡和IPL的变薄。高剂量枸杞多糖(400 mg·kg－1)对正常视网膜无影响(Fig 1)。

3.2 视网膜NMDAR2A的表达 Western blot检测结果显示，正常对照组视网膜组织NMDAR2A蛋白表达较低。玻璃体内注射NMDA后，NMDAR2A的蛋白表达明显增高(P＜0.01)。枸杞多糖(100、200 和 400 mg·kg－1)明 显 降 低 NMDA 所 致NMDAR2A的蛋白表达增多(P＜0.01)，并且NMDA+LBP 200和400 mg·kg－1组使 NMDAR2A的表达基本降到正常水平。高剂量枸杞多糖(400 mg·kg－1)对正常视网膜NMDAR2A的蛋白表达无影响(Fig 2)。

Fig 2 Effect of LBP on expression of NMDAR2A in NMDA treated rats

3.3 视网膜eNOS和iNOS的表达 Western blot检测结果显示，与正常对照组比较，NMDA组eNOS的表达明显降低(P＜0.01)。枸杞多糖(100、200和400 mg·kg－1)可明显抑制NMDA致eNOS表达的减少(P＜0.01)。高剂量枸杞多糖(400 mg·kg－1)对正常视网膜 eNOS蛋白表达无影响(Fig 3B)。正常对照组视网膜组织中iNOS几乎不表达。玻璃体内注射NMDA后，视网膜iNOS蛋白表达明显增高(P＜0.01)。枸杞多糖(100、200和400 mg·kg－1)可明显抑制NMDA致iNOS表达的增多(P＜0.01)。高剂量枸杞多糖(400 mg·kg－1)对正常视网膜iNOS蛋白表达无诱导作用(Fig 3C)。

4 讨论

本实验研究了枸杞多糖对NMDA致大鼠视网膜损伤的保护作用及其机制。研究结果显示，大鼠眼玻璃体内注射NMDA后，视网膜的厚度变薄，细胞数量减少，细胞层次减少，而其中尤以神经节细胞层(GCL)和内丛状层(IPL)损伤最为明显，神经节细胞明显减少，胞内空泡样变性，核固缩浓染，IPL明显变薄，这与Mori等研究报道一致［5］。枸杞多糖可以减轻视网膜病理损伤，以200、400 mg·kg－1给药最为明显。提示，枸杞多糖对NMDA诱导的大鼠视网膜损伤有保护作用。

Fig 3 Effect of LBP on expression of eNOS and iNOS in NMDA treated rats

兴奋性氨基酸对视网膜内层细胞具有毒性作用。大量文献报道，NMDA激动其受体介导的兴奋性毒性与视网膜缺血和青光眼等多种眼部疾病有关［6－7］。NMDA 受体至少有五个亚基:NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B、NMDAR2C、NMDAR2D。其中NMDAR1是NMDA受体一个基本亚基，没有它受体将没有功能。NMDAR2A～D亚基可能是调节亚基［8］。NMDAR1在视网膜的兴奋性毒性损伤中不发挥作用，而NMDAR2A与氨基酸兴奋性毒性损伤机制有关［9］。本实验研究结果显示，NMDA可诱导大鼠视网膜组织NMDAR2A蛋白表达增加，这与Matteucci等［10］研究报道相一致。枸杞多糖干预后可使大鼠视网膜组织NMDAR2A表达降低，提示，枸杞多糖可抑制大鼠视网膜组织中NMDAR2A表达的上调。

越来越多的证据表明，一氧化氮在视网膜的生理性修复及病理过程中发挥重要作用［11］。一氧化氮由L-精氨酸在一氧化氮合酶(NOS)作用下生成。NOS包括:神经型(nNOS)、内皮型(eNOS)和诱导型(iNOS)3种。nNOS和eNOS为结构型，在正常视网膜细胞中表达，催化生成生理量的一氧化氮，对视网膜产生保护作用，在视网膜损伤时，表达下降。iNOS为诱导型，正常情况下不表达，在视网膜受各种病理损伤性刺激后大量表达，导致大量具有自由基毒性作用一氧化氮过量的生成，对视网膜产生损伤作用［12］。NMDA受体激活后，可开放电压门控性钙通道引起钙离子内流，激活钙离子敏感的酶，其中包括iNOS表达的增加。同时钙离子升高诱导产生大量超氧阴离子并与一氧化氮结合，生成过氧亚硝酸基，诱导神经节细胞凋亡［13］。本实验研究发现，NMDA玻璃体注射的大鼠视网膜组织中eNOS蛋白表达下降，iNOS蛋白表达明显增加，这与Nakamichi等研究报道一致［14］。不同剂量枸杞多糖给药后，尤其高剂量枸杞多糖可以有效的逆转由NMDA诱导损伤的大鼠视网膜组织中eNOS表达下调和iNOS表达的上升。提示，枸杞多糖对由NMDA诱导的大鼠视网膜损伤保护作用的机制与抑制eNOS/iNOS异常表达有关。

综上所述，枸杞多糖对NMDA致大鼠视网膜损伤具有保护作用，其机制与调控视网膜NMDAR2A表达以及eNOS/iNOS水平有关。由于视网膜病变存在多种发生机制［15］，枸杞多糖对视网膜病变的保护是否通过其他作用靶点，尚需进一步研究。

［1］李德远，徐为春，苏喜生，等.枸杞多糖抗辐射效应研究［J］.中国药理学通报，2003，19(7):839.

［1］Li D Y，Xu W C，Su X S，et al.Antiradiation effect of lycium barbarum polysaccharide［J］.Chin Pharmacol Bull，2003，19(7):839.

［2］Mi X S，Feng Q，Amy L，et al.Protection of retinal ganglion cells and retinal vasculature by lycium barbarum polysaccharides in a mouse model of acute ocular hypertension［J］.PLoS One，2012，7(10):e45469.

［3］杨新波，黄正明，曹文斌，等.枸杞多糖对正常小鼠及四氧嘧啶糖尿病小鼠血糖的影响［J］.中国药理学通报，1996，12(6):505.

［3］Yang X B，Huang Z M，Cao W B，et al.Effects of lycium bararum polysaccharide(LBP)on bloodglucose in normal and diabetic mice［J］.Chin Pharmacol Bull，1996，12(6):505.

［4］Kawasaki A，Han M H，Wei J Y，et al.Protective effect of arachidonic acid on glutamate neurotoxicity in rat retinal ganglion cells［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2002，43(6):1835－ 42.

［5］Mori A，Ishii T，Kuroki T，et al.The prostanoid EP(2)receptor agonist ONO-AE1-259-01 protects against glutamate-induced neurotoxicity in rat retina［J］.Eur J Pharmacol，2009，616(1－3):64－7.

［6］Osborne N N，Casson R J，Wood J P，et al.Retinal ischemia:mechanisms of damage and potential therapeutic strategies［J］.Prog Retin Eye Res，2004，23(1):91－47.

［7］Kuehn M H，Fingert J H，Kwon Y H，et al.Retinal ganglion cell death in glaucoma:mechanisms and neuroprotective strategies［J］.Ophthalmol Clin North Am，2005，18(3):383－95.

［8］Fan W，Xing Y Q，Zhong Y M，et al.Expression of NMDA receptor subunit 1 in the rat retina［J］.Acta Histochem，2013，115(1):42－7.

［9］杜改萍，张世杰，王睁华.N-甲基-D-天门冬氨酸受体亚型NR1、NR2A在大鼠视网膜缺血再灌注损伤模型中的表达［J］.眼科，2003，12(3):170－4.

［9］Du G P，Zhang S J，Wang Z H.The expression of receptor(NMDAR)subunits NR1 and NR2A in the rat model of retinal ischemia reperfusion injury［J］.Ophthalmol CHN，2003，12(3):170－4.

［10］Matteucci A，Cammarota R，Paradisi S，et al.Curcumin protects against NMDA-induced toxicity:a possible role for NR2A subunit［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2011，52(2):1070－7.

［11］Kim W T，Suh E S.Retinal protective effects of resveratrol via modulation of nitric oxide synthase on oxygen-induced retinopathy［J］.Korean J Ophthalmol，2010，24(2):108－18.

［12］Vielma A H，Retamal M A，Schmachtenberg O.Nitric oxide signaling in the retina:what have we learned in two decades［J］.Brain Res，2012，1430:112－25.

［13］Li L，Huang Z，Xiao H，et al.Effect of PBNA on the NO content and NOS activity in ischemia/reperfusion injury in the rat retina［J］.Adv Exp Med Biol，2010，664:501－ 7.

［14］Nakamichi N，Chidlow G，Osborne N N.Effects of intraocular injection of a low concentration of zinc on the rat retina［J］.Neuropharmacol，2003，45(5):637－48.

［15］高 杨，邓新国，孙倩娜，等.灵芝孢子油对N-甲基-N-亚硝酸脲诱导的大鼠视网膜损伤中Caspase-3表达的影响［J］.中国药理学通报，2009，25(7):871－5.

［15］Gao Y，Deng X G，Sun Q N，et al.Effect of ganoderma spore oil on Caspase-3 expression in rat retina with photoreceptor damage induced by N-methy-N-nitrosourea［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25(7):871－5.