荞麦芽提取物抗突变和抑制肿瘤作用的实验研究

孙国娟，李善姬，崔泰花，崔承弼，*

(1.延边大学医学院，吉林延吉133002;2.吉林医药学院公共卫生院，吉林132013;3.延边大学农学院，吉林延吉133002)

荞麦为蓼科荞麦属双子叶禾谷类植物，是一种重要的杂粮作物，我国广泛种植的品种主要有甜荞和苦荞两种［1］。近年来医学、农业及食品营养学等方面的研究不断表明［2］，荞麦的营养价值位居所有粮食作物之首，因其丰富的营养成分，以及较高的营养价值，素有“五谷之王”的美誉。同时荞麦还含有其他禾谷类粮食作物所没有的叶绿素和类黄酮物质，特别是芦丁的含量很高。芦丁有软化血管，降低血糖，调节血压，降低血清胆固醇的作用，同时对预防和治疗高血压、心脑血管疾病等均有一定的药理作用［3］。最近已有研究报道，荞麦具有抗突变和抗肿瘤的作用，但对荞麦芽的一些保健功能仍需进一步研究和开发。本实验以荞麦芽为研究对象，以小鼠骨髓细胞微核和小鼠S－180移植性肿瘤为观察指标，对荞麦芽提取物的抗突变和抑制肿瘤的药效作用进行了研究，为荞麦资源的深度开发与利用提供一些理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

荞麦 山西省农科院小杂粮研究中心提供;实验动物 SPF级 Balb/c、ICR小鼠，体重18～22g，雌雄各半，由延边大学实验动物中心提供;小鼠S－180肉瘤细胞株 由中国药科大学抗肿瘤药物实验室提供;胎牛血清 杭州四季青生物工程材料有限公司;Giemsa色素 天津博迪化工有限公司;N－甲基－N－硝基－N－亚硝基胍(MNNG) 日本和光纯药有限公司;甲醇、甘油、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、乙醇、正己烷、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇等 均为分析纯。

FW－200型高速万能粉碎机 北京中兴伟业仪器有限公司;JA10003N型电子天平 民桥精密科学仪器有限公司;HH－S型恒温水浴锅 金坛市恒丰仪器厂;MCO－5AC型CO2培养箱 日本三洋公司;XDS1D型倒置显微镜 上海万衡精密仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 荞麦芽提取物的制备 麦芽(长度12～16cm，下胚轴厚度约1.8～1.9cm)用粉碎机粉碎成粉末，然后添加样品重量10倍的70%乙醇浸泡，在80℃的条件下，每浸泡8h提取一次，共提取3次。合并3次提取液，用减压过滤装置进行热态过滤后，再减压浓缩回收乙醇提取物。取部分提取物加适量水溶解后，根据溶剂不同的极性，依次用2～3倍正己烷、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和水5种溶剂进行萃取，收集各萃取液，包括母液共得到6个不同极性的粗体部位。最后减压浓缩，进行冻结干燥，保存备用［4］。

1.2.2 小鼠骨髓细胞微核实验 动物适应性饲养1～2d，无异常后开始实验，选用健康状况良好体重18～25g的ICR小鼠每组10只，雌雄各半。根据预实验结果，设置荞麦芽苗乙醇提取物及各萃取物溶液10、20、40、80mg/kg 4 个剂量组及阴性对照组(蒸馏水)和致突变物对照组(MNNG 150mg/kg)，按0.2mL/25g灌胃给药，连续7d，对照组同时以蒸馏水灌胃。实验末期(最后2d)，给药组及致突变物对照组给予致突变物MNNG 2次，给药时间间隔24h，最后一次给药后6h将各实验组动物颈椎脱臼处死，取两腿股骨，剔除肌肉，用纱布擦除碎肉和血污，剪去股骨两端的骨骺后，将吸取适量小牛血清带针头的2mL注射器插入骨髓腔内，使骨髓迅速冲入到离心管中，然后待骨髓团块与小牛血清混合均匀后，在离心机内离心10min(1000r/min)，弃掉多余的上清液，留下约0.5mL上清液与沉淀物混和均匀后，用滴管吸取适量，滴在清洁的载玻片上进行涂片，长度约为2～3cm，在空气中晾干。将已干燥的涂片在甲醇中固定15min左右，然后在Giemsa应用液中染色15min后立即用pH6.8磷酸缓冲液冲洗，阴凉干燥处保存。在油镜下选择细胞分散好、形态完整、染色良好的部位，按一定顺序进行计数。油镜下观察1000个嗜多染红细胞(PCE)中微核(MN)出现的千分率［5－7］。

1.2.3 小鼠 S－180肉瘤细胞株实验 选择培养7～10d的生长良好的瘤株，无菌取腹腔积液，用0.9%无菌生理盐水按1∶3稀释成瘤细胞悬液，并计数调整细胞浓度为1×107个/mL，用体重18～20g的Balb/c小鼠42只，每只0.2mL接种至小鼠右侧腋窝下。24h后选择一般状态良好的小鼠，称重后随机分为7组:空白对照组、乙醇提取物组、正己烷提取物组、氯仿提取物组、乙酸乙酯提取物组、正丁醇提取物组及水提取物组。每组6只，各组溶液灌胃给药，给药剂量为0.5mg/kg·d，连续给药20d，空白对照组给予同体积的0.9%氯化钠溶液，停药次日处死动物。解剖剥离瘤块，称瘤重，计算肿瘤生长抑制率［8－10］。

肿瘤抑制率(%)=空白对照组平均瘤重－实验组平均瘤重/空白对照组平均瘤重×100

1.3 统计学方法

应用SPSS10.0中相应程序对数据进行统计学处理，各实验数据以均数±标准差表示，采用单因素方差分析进行检验，p＜0.05为显著性检验标准。

2 结果与分析

2.1 荞麦芽提取物对小鼠骨髓细胞微核的抑制作用

荞麦芽提取物对小鼠骨髓细胞微核的作用结果如表1所示，阴性对照组小鼠的骨髓微核率最低，阳性对照组与荞麦芽提取物4个剂量组的微核率均显著高于阴性对照组(p＜0.05)。而不同剂量的荞麦芽各提取物组与阳性对照组相比微核率显著下降(p＜0.05)。并且各提取物组随着浓度的增高，微核率逐渐降低，抑制率的效果逐渐增强。其中荞麦芽乙醇提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物在80mg/kg浓度下，对小鼠骨髓微核的作用效果最好，抑制率达73.4%、75.8%、74.2%。荞麦芽提取物对MNNG诱发的小鼠骨髓细胞微核的发生有明显的抑制效果。

表1 荞麦芽提取物对小鼠骨髓细胞微核的抑制作用Table 1 The inhibition of buckwheat sprouts extracts on bone marrow cells of mice

2.2 荞麦芽提取物对小鼠S－180肉瘤生长的抑制作用

荞麦芽提取物对小鼠S－180肉瘤生长的抑制作用见表2。由表2可以看出，各成分处理组小鼠平均瘤重低于对照组，各活性成分对肉瘤均有一定的抑制作用。其中，乙醇提取物、乙酸乙酯提取物对小鼠S－180肉瘤的生长有明显的抑制作用，抑瘤率分别为39.5%、38.0%，与空白对照组比较有显著差异(p＜0.05)。

表2 荞麦芽提取物对小鼠S－180肉瘤生长的抑制作用Table 2 The inhibition of buckwheat sprouts extracts on tumor bearing Balb/c mouse

3 讨论

3.1 微核与染色体损伤有关，是染色体或染色单体的无着丝点断片或纺锤丝受损而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期遗留在细胞质中，末期之后，单独形成一个或几个规则的次核，包含在子细胞的胞质中，比主核小，大小相当于细胞直径的1/20～1/5，呈圆形或杏仁状，故称微核［11］。骨髓细胞微核分析是检测化学品对嗜多染红细胞干细胞所产生的致染色体畸变作用，因其快速、简便的特点很快成为广泛使用的遗传毒理学实验方法之一。国际组织也将其规定为评价食品添加剂、农药、新药等化合物的安全性必做实验之一［12］。而且，此法节省了在处理细胞群中寻找中期相的时间，同时也比分析染色体畸变要方便一些。但是该实验也受到许多因素的影响，例如小鼠品系、剂量、给药次数、给药途径、取材部位等。因此，骨髓细胞微核分析方法有待于进一步的研究与探讨。

3.2 恶性肿瘤是目前危害人们生命和健康的恶性疾病之一，2010年癌症已经超越心、脑血管疾病成为21世纪人类的第一杀手，同时也成为全球最大的公共卫生问题之一。因此，寻找癌症的预防与治疗方法受到国际科学工作者的普遍关注和高度重视［13］。而化合物合成的抗癌药对人体正常细胞可能产生毒副作用，因此从天然动、植物中寻找毒性低、疗效高的抗癌活性成分仍是近年来国内外科学工作者研究的热点之一［14］。荞麦作为药食两用植物，不仅含有丰富的蛋白质、碳水化合物、不饱和脂肪酸，而且含有其它粮食作物所没有的黄酮类化合物，而黄酮类化合物在抗肿瘤方面的作用是目前研究的热点之一，其抗肿瘤作用主要表现在抗细胞增殖、诱导细胞凋亡等方面［15］。所以本实验对荞麦芽提取物对小鼠S－180肉瘤生长的抑制作用进行研究，结果荞麦芽提取物具有一定的抗肿瘤活性，我国具有丰富的荞麦资源，荞麦芽具有抗肿瘤作用的研究成果将有利于促进荞麦资源的深度开发与利用，将为保健食品开发利用提供理论依据。

4 结论

4.1 在小鼠骨髓细胞微核实验中，荞麦芽提取物对诱导物MNNG导致的染色体损伤具有保护作用，其中荞麦芽乙醇提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物在80mg/kg浓度下，对小鼠骨髓微核的作用效果较好，抑制率达73.4%、75.8%、74.2%。

4.2 在肿瘤的抑制实验中，荞麦芽提取物对小鼠S－180肉瘤细胞移植性肿瘤均有抑制效果。其中乙醇提取物、乙酸乙酯提取物对小鼠S－180肉瘤的生长抑制作用最为明显，抑瘤率分别为39.5%、38.0%。

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