固态发酵食醋有机酸组成分析中样品预处理方法的研究

余永建，邓晓阳，陆震鸣，史劲松，许正宏，3，*

（1.江南大学药学院制药工程研究室，江苏无锡 214122；2.江南大学药学院生物活性制品加工工程研究室，江苏无锡214122；3.国家固态酿造工程技术研究中心，四川泸州 646000）

传统固态酿造食醋具有悠久的历史，是深受我国人民喜爱的一种调味品[1]。发酵食醋中有机酸种类丰富，除乙酸外尚存在乳酸、苹果酸、柠檬酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、富马酸等多种不挥发酸，对食醋的口感具有重要影响[2]。例如，琥珀酸可增强醋的鲜味，乳酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸等可以缓冲乙酸的刺激性，使醋液酸味柔和、醇厚。食醋中有机酸主要来源于固态酿造过程中各种微生物的代谢活动，且不同酿造原料和工艺生产的食醋中有机酸组成差别较大。准确测定食醋中有机酸的种类和含量，对于评价食醋品质及解析食醋酿造机理具有重要意义。已有学者采用包括高效液相色谱法（HPLC）、离子排斥色谱法、气相色谱法在内的多种现代仪器分析方法测定了发酵食醋有机酸的组成[3-5]，其中HPLC具有高效快速、灵敏度高、稳定性好等优点，使用最为普遍。另一方面，食醋中除了富含有机酸以外，还含有大量蛋白质、多糖、果胶等生物大分子物质，以及色素、鞣质、无机盐等小分子物质。这些物质的存在容易导致食醋有机酸HPLC分析过程中柱压升高、使用寿命降低、有机酸分离度下降等问题，因此样品一般需要经过前处理，以去除干扰物质。本论文对食醋有机酸分析过程中的样品预处理方法进行研究，比较了4种大分子杂质沉淀方法，以及4种小分子杂质去除方法对食醋样品预处理及有机酸定量分析结果的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

固态发酵食醋样品 从市场购得，总酸含量分别为4.5、5.0、5.5、6.0g/100mL；磷酸、磷酸二氢钠、亚铁氰化钾、硫酸锌、乙酸 均为分析纯，中国医药（集团）上海化学试剂公司；甲醇 色谱纯，中国医药（集团）上海化学试剂公司；草酸、丙酮酸、柠檬酸、乳酸、酒石酸、琥珀酸、富马酸、苹果酸 均为色谱纯，Sigma-Aldrich（上海）公司；有机酸标样溶液（mg/mL）

草酸0.50，酒石酸2.01，丙酮酸1.10，α-酮戊二酸0.22，乳酸25.02，乙酸49.99，柠檬酸2.00，焦谷氨酸2.01，琥珀酸4.00。

pH计、电子天平 Mettler Toledo仪器（上海）有限公司；高效液相色谱 DIONEX公司；固相萃取小柱 Sep-Pak C18，Supelclean LC-SAX，Supelclean LCNH2，美国Waters公司。

1.2 实验方法

1.2.1 沉淀剂的选择 分别取5mL不同总酸含量（4.5、5.0、5.5、6.0g/100mL）的醋样，加入5mL已知浓度的有机酸标样，然后按照下述4种方法分别进行蛋白沉淀。

1.2.1.1 亚铁氰化钾-硫酸锌沉淀法 加入2mL 10.6%亚铁氰化钾（10.6g用水定容至100mL）和2mL 30%硫酸锌（30g用水定容至100mL）溶液，摇匀后用超纯水定容至100mL，静置0.5h后用双层滤纸过滤，取滤液。

1.2.1.2 亚铁氰化钾-乙酸锌沉淀法 加入2mL 10.6%亚铁氰化钾和2mL的21.9%乙酸锌（21.9g加冰乙酸3mL，加水定容至100mL）溶液，摇匀后用超纯水定容至100mL，静置0.5h后用双层滤纸过滤，取滤液。

1.2.1.3 乙醇沉淀法 缓慢加入30mL无水乙醇，10000r/min离心10min后取上清液。

1.2.1.4 三氯乙酸沉淀法 缓慢加入10mL三氯乙酸（10%），10000r/min离心10min后取上清液。

分别取经上述沉淀处理后的样品用0.22μm微孔滤膜过滤，滤液再用Sep-Pak C18固相萃取小柱进行处理后进行HPLC分析，测定有机酸的加标回收率。

1.2.2 小分子杂质去除方法的比较 取4种不同总酸含量（4.5、5.0、5.5、6.0g/100mL）的醋样5mL，加入5mL已知浓度的标样，用1.2.1中确定的蛋白沉淀方法进行处理，上清液用0.22μm微孔滤膜过滤，滤液采用固相萃取小柱或活性炭进行处理，具体方法如下。

1.2.2.1 Sep-Pak C18固相萃取小柱 小柱用5mL甲醇进行活化，然后用5mL超纯水平衡；将样品溶液缓慢流过小柱，流速1mL/min。

1.2.2.2 Supelclean LC-SAX固相萃取小柱 小柱用5mL甲醇活化，然后用5mL超纯水平衡；用5%氨水将样品溶液的pH调至8，上样量为1mL；用2mL超纯水淋洗杂质；用6%盐酸洗脱有机酸，洗脱体积为1.5mL，洗脱速度为1mL/min[6]。

1.2.2.3 Supelclean LC-NH2固相小柱 操作方法同1.2.2.2中LC-SAX小柱。

1.2.2.4 活性炭 取5mL样品，加入0.25g活性炭粉脱色30min，双层滤纸过滤后再用0.22μm微孔滤膜过滤。

经过上述方法处理的样品分别进行HPLC分析，测定有机酸的加标回收率。

1.2.3 加标回收率的计算 分别取5mL不同总酸含量（4.5、5.0、5.5、6.0g/100mL）的醋样，加入5mL已知浓度的有机酸标样，分别按照上述确定的沉淀、除杂方法进行处理后进行HPLC分析，计算有机酸的加标回收率。

式中：x，加标回收率（%）；C1，醋样中有机酸的浓度（g/100mL）；C2，加标醋样中有机酸的浓度（g/100mL）；C0，有机酸标准液浓度（g/100mL）；V0，加标体积（mL）；V，加标后醋样总体积（mL）。

1.2.4 HPLC分析条件 色谱柱，Waters Atlantis d C18（4.6mm×150mm×5μm）；柱温，30℃；流动相，20mmol/L NaH2PO4，用磷酸调pH至2.7；进样体积10μL；流速0.7mL/min；检测器UV波长210nm。

以保留时间和样品加标定性，将各种有机酸标准溶液在同样的色谱条件下分别进样，绘制有机酸浓度-峰面积标准曲线，采用峰面积外标法定量。

2 结果与分析

2.1 沉淀剂的选择

实验结果表明，亚铁氰化钾-硫酸锌沉淀法（图1b）和亚铁氰化钾-乙酸锌沉淀法（图1c）均可有效地沉淀蛋白质，且易于过滤，对所测有机酸的吸附小；乙醇沉淀法（图1d）使醋样中各有机酸的分离度不好，特别是乳酸和乙酸；三氯乙酸法（图1e）处理醋样后，部分有机酸的分离度、对称因子较差，影响定性与定量。

图1 不同沉淀法处理后醋样有机酸的HPLC色谱图Fig.1 Chromatograms of organic acids in vinegars after precipitation

采用亚铁氰化钾-硫酸锌沉淀法时，不同总酸含量的食醋有机酸加标回收率为90.2%～110.0%（表1），说明该沉淀法适用于不同酸度食醋的有机酸分析。而采用亚铁氰化钾-乙酸锌法时，酒石酸与乳酸回收率较低，分别为65.4%～70.3%和50.1%～53.4%；另外，由于乙酸锌溶液里含有乙酸根，需要设置空白对照实验并计算去除相应的浓度。根据图1结果，采用乙醇处理和三氯乙酸处理时，醋样中各有机酸的分离度不高，因此未对这两种预处理方法进行回收率实验。综上，亚铁氰化钾-硫酸锌法具有沉淀能力强、对有机酸分析干扰小、稳定性好、适用于不同酸度醋样的优点，因此本实验选用该沉淀法用于去除醋样中大分子杂质。

表1 不同沉淀处理对食醋有机酸加标回收率的影响Table 1 Effect of precipitation on recoveries of organic acids in vinegars

2.2 小分子杂质去除方法的比较

有机酸的前处理一般可采用液液萃取技术，以除去干扰物，但液液萃取时间长，需使用有机溶剂，不利于环境和健康[7-8]。本实验考察了不同固相萃取小柱及活性炭对醋样中小分子杂质的去除效果和有机酸加标回收率的影响。

结果表明（表2），C18固相萃取小柱对醋样的脱色效果较好，处理后样品呈无色透明状，不同酸度醋样的有机酸加标回收率都比较高。

LC-SAX是以硅胶为基质的强阴离子交换萃取柱，适合弱酸的提取。LC-NH2是以硅胶为基质的氨丙基萃取柱，具有极性固定相和弱阴离子交换剂，可通过极性吸附或阴离子交换达到保留作用，因此具有双重作用。用LC-SAX、LC-NH2两种小柱色谱图中各有机酸分离较好，杂质干扰小，但是处理样品时间较长，不同有机酸的回收率均不理想（表2）；除了α-酮戊二酸的回收率能达到85%以上，其余的有机酸回收率普遍偏低，而且不同酸度醋样的有机酸回收率相差较大。

活性炭具有较强的吸附作用，能够吸附各种有机物和色素，经过活性炭脱色的样品溶液无色透明，样品色谱图中各有机酸分离度较好（色谱图未给出），但是大部分有机酸的回收率偏低（表2）。表明活性炭的吸附能力太强，吸附杂质的同时，几乎所有的有机酸被吸附，其含量都有不同程度的下降，因此本法不宜采用。

综上，本实验选用Sep-Pak C18固相萃取小柱处理醋样，以排除色素等小分子杂质。

表2 不同固相萃取小柱回收率的比较Table 2 Recoveries of organic acids in vinegars

3 结论

本实验确定的食醋预处理方法为：取5mL醋样置于100mL容量瓶中，分别加入2mL亚铁氰化钾（10.6%）和2mL硫酸锌（30%），摇匀后用超纯水定容，静置0.5h后用双层滤纸过滤。滤液用0.22μm微孔滤膜过滤，然后采用Sep-Pak C18固相萃取小柱处理，所得溶液用于有机酸的HPLC分析。该预处理方法简单，操作方便，成功地排除了食醋中蛋白、色素等杂质对有机酸HPLC分析的干扰。

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