酶法降解小麦秸秆碱预处理浓度的选择及酶解产物的检测

刘沙沙，李静梅，吴 颖，石 波，*，梁 平，OJOKOH Eromosele solomon

（1.中国农业科学院饲料研究所，北京100081；2.中国农业科学院作物科学研究所，北京 100081；3.北京市产品质量监督检验所，北京100029）

小麦秸秆是农作物生产过程中的主要副产物之一，是一种可重复获得的绿色资源，主要成分为纤维素、半纤维素和木质素。木质纤维素的组成成分复杂、性质稳定，使得其生物降解难以迅速进行，因此需要借助化学的、物理的方法进行预处理，使纤维素与木质素、半纤维素等分离开，打开纤维素内部氢键，使结晶纤维素成为无定型纤维素，进一步打断部分β-1，4糖苷键，降低纤维素聚合度[1-2]。纤维素经酸或酶水解，然后经过分离纯化可得到高纯度的单一聚合度的纤维寡糖[3-5]。纤维寡糖是由2～10个葡萄糖分子通过β-1，4糖苷键连接起来的低聚糖，由于人体肠道内没有能降解β-1，4糖苷键的酶，因此纤维寡糖不易被人体消化吸收，属于功能性低聚糖范畴[6]。目前，已有多种木质纤维素原料预处理的方法[7]，主要包括物理法、化学法、物理化学法和生物法。其中化学碱处理方法中的NaOH预处理是发现最早、应用最广、比较有效的植物纤维素原料的预处理方法[8]。De Vrije等[9]用碱70℃处理芒草后，进行酶降解，木质素去除率达到77%，纤维素转化率达95%，半纤维素转化率44%；郭德宪等[10]将小麦秸秆经过NaOH处理后，用里氏木霉产纤维素酶对其降解，结果经过NaOH处理的小麦秸秆转化率提高了15%；Weil等[11]研究发现，NaOH有较强的脱木质素作用，原料除去了木质素后，酶水解糖化率显著提高。本研究旨在探索小麦秸秆的最佳碱处理浓度，并对预处理后的小麦秸秆进行酶降解及降解产物的分析，以提高小麦秸秆的利用率，同时为纤维类寡糖生产原料和方法的选择提供一定的研究依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

小麦秸秆 产自河北沧州；β-葡聚糖酶 酶活3000万u/g，购于宁夏夏盛实业有限公司；乙腈 色谱纯，Fisher；葡萄糖（纯度99.8%）、木糖（纯度99.0%）Sigma；氢氧化钠、盐酸、硫酸等 国产分析纯；水 去离子水。

IKA加热磁力搅拌器 德国IKA；RE-3000旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；FW100超速万能粉碎机 天津泰斯特仪器有限公司；BME-100L高剪切混合乳化机 上海威宇机电制造公司；FD-1D真空冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司；2695/2414高效液相色谱仪及示差折光检测器，美国Waters；PB-21pH计 德国Sartorius。

1.2 实验方法

1.2.1 小麦秸秆的碱法预处理 称取小麦秸秆400g，万能粉碎机粉碎后，放在纱网上，用自来水清洗2～3次以去除灰尘（至滤出液澄清即可）。滤渣滤干后放入装有5L浓度分别为0%、1%、2%、3%、4%NaOH的容器中，在50℃水浴搅拌2h后，再在室温（25℃）下搅拌过夜。用纱网过滤，并用自来水洗涤滤渣至pH=6～7（pH检测中性），滤渣滤干后，放入装有约5L水的容器中，高剪切乳化机11000r/min乳化20min后，纱网过滤，冷冻干燥，备用。

1.2.2 预处理后秸秆主要成分的检测 准确称取预处理后的小麦秸秆300mg（精确至0.0001g）于研钵中，加入72%硫酸溶液3.5mL连续研磨2h，用100mL蒸馏水将研磨液转移至250mL三角瓶中，100℃沸水浴煮沸2.5h，冷却至室温，加入适量BaCO3，充分搅拌至溶液pH为7左右，滤纸过滤，蒸馏水反复洗涤滤渣直至苯酚-硫酸法检测无糖，滤液真空旋转浓缩并定容至5mL，过0.22μm水膜，用HPLC检测。色谱条件为：色谱柱：Sugar-D（4.6mm×250mm，5μm）；检测器：示差折光检测器；流动相：乙腈∶水（3∶1，v∶v）；流速：0.8mL/min；检测温度：30.0℃；进样体积：10μL。

分别以葡萄糖及木糖浓度（Y）为纵坐标，峰面积（X）为横坐标，绘制葡萄糖及木糖的标准曲线（图1～图2）。所得葡萄糖标准曲线方程为：y=10-5x+0.6346（r=1）；所得木糖标准曲线方程为：y=10-5x+0.8224（r=0.9996）。

图1 葡萄糖标准曲线Fig.1 A linear standard curve of glucose

图2 木糖标准曲线Fig.2 A linear standard curve of xylose

纤维素及半纤维素根据以下公式[12]计算：纤维素含量=葡萄糖含量×0.9；半纤维素含量=木糖含量×0.88。

1.2.3 β-葡聚糖酶降解预处理小麦秸秆 准确称取1g（精确至0.0001g）预处理后小麦秸秆，加蒸馏水50mL，搅拌均匀，用0.1mol/L NaOH和0.1mol/L HCL调节pH至4.8，搅拌升温至50℃后，加入β-葡聚糖酶反应2h，沸水灭活10min，冷却，滤纸过滤，滤渣烘干后称重，计算酶解转化率（见下式），滤液浓缩定容，HPLC及荧光辅助糖电泳法（FACE）检测酶解产物成分。

酶解转化率（%）=（1－烘干后滤渣的重量）/1×100。

FACE检测条件：单一聚合度纤维寡糖经荧光衍生16h，分离胶为35%丙烯酰胺凝胶，浓缩胶为4%丙烯酰胺凝胶，正极缓冲液：（0.1mol/L Tris-HCl pH8.2），负极缓冲液：（0.15mol/L Tris-glycine pH8.5），400V电压电泳1h后，1000V电泳到荧光前沿到达距离分离胶底部约1cm。

2 结果与讨论

2.1 小麦秸秆主要成分的含量测定及最佳碱处理浓度的选择

2.1.1 HPLC检测硫酸降解预处理小麦秸秆产物 碱预处理过的小麦秸秆经过72%H2SO4降解后，HPLC检测其主要产物见图3。通过与标准品谱图（图4、图5）比对，确定碱预处理过的小麦秸秆经过72%H2SO4降解后主要产物为木糖和葡萄糖，因此，原小麦秸秆的主要纤维成分为纤维素和半纤维素。

2.1.2 最佳碱预处理浓度的选择及酶解转化率 经不同浓度NaOH溶液预处理后的小麦秸秆纤维素及半纤维素含量、2h酶降解反应转化率结果如表1所示。

图3 经72%H2SO4降解的碱预处理过小麦秸秆HPLC谱图Fig.3 HPLC chromatogram of pretreated wheat straw hydrolyzted with 72%H2SO4

图4 木糖标准品谱图Fig.4 HPLC chromatogram of xylose

图5 葡萄糖标准品谱图Fig.5 HPLC chromatogram of glucose

由表1可以看出，经不同浓度NaOH溶液处理后，小麦秸秆中纤维素、半纤维素含量及酶降解转化率结果不同。由纤维素的含量可以看出，经过NaOH预处理的小麦秸秆纤维素的含量高于不经碱预处理的；从半纤维素的含量可以看出，NaOH浓度大于1%时，半纤维素保留量降低；经1%NaOH溶液处理的小麦秸秆酶解2h转化率为20.08%，高于其他三组。综合考虑以上三个因素及碱浓度升高对后续处理带来的不便，选择小麦秸秆预处理的最佳NaOH浓度为1%。

表1 纤维素、半纤维素含量及酶解转化率的比较Table 1 The cellulose,hemicellulose and enzymatic convertion rate of pretreated wheat straw

2.2 小麦秸秆主要酶降解产物分析

碱处理过的小麦秸秆经β-葡聚糖酶降解后的HPLC测定结果如图6所示。通过与纤维二糖标准品（图7）及木糖、葡萄糖单糖标准品（图4～图5）对比，可以推测其主要的寡糖酶降解产物为纤维二糖。

图6 β-葡聚糖酶降解碱处理小麦秸秆产物HPLC谱图Fig.6 HPLC chromatogram of pretreated wheat straw hydrolyzed with β-glucanase

图7 纤维二糖标准品HPLC谱图Fig.7 HPLC chromatogram of cellobiose

为了进一步确定小麦秸秆酶降解产物的成分，对β-葡聚糖酶降解碱处理小麦秸秆的酶解液进行荧光标记并用荧光辅助糖电泳（FACE）检测，结果如图8所示。由图8可以看出，此酶解液中除主要含有纤维二糖外，还有多种其他的寡糖产物。

图8 β-葡聚糖酶降解碱处理小麦秸秆产物的FACE谱图Fig.8 FACE chromatogram of pretreated wheat straw hydrolyzed with β-glucanse

研究表明，纤维寡糖具有多项生理功能，是双歧杆菌的增殖因子，能预防便秘，降低冠状心脏疾病和癌症的发病率，降低血清中胆固醇含量，促进矿物质吸收等功效[13-14]，可用于食品、饲料和保健、医药工业等，还可用于生物化学和微生物学等领域的研究，具有广阔的市场前景[15]。国外学者证实口服纤维二糖不引起人体血糖水平变化，可以用作糖尿病患者的甜味剂[16]。

我国有丰富的纤维素资源，仅农作物秸秆年产量就达6亿多吨，但目前其利用率不到30%[17]，开发利用农作物秸秆资源用于制备纤维类寡糖产品，为生物质资源找到了新的出路，既能减少生物质资源浪费，又可以为纤维类寡糖的生产找到低价原料、降低生产成本，具有重要的研究意义。

然而，木质纤维素组分结构复杂，未处理的木质纤维素很难直接被酶降解，找到合适的木质纤维素预处理条件，可以很大程度上提高其降解性能，在提高酶和秸秆原料的利用率、缩短反应时间上都有重大意义。Chosdu等[18]采用电子束照射和2%NaOH相结合处理玉米秸秆等原料，酶解后葡萄糖得率显著提高。MadsA等[19]研究了物理法预处理对小麦秸秆酶解效果的影响，结果表明预处理改变了小麦秸秆结构，可以提高酶对秸秆的降解效率。本研究用不同浓度的NaOH对经粉碎过后的小麦秸秆进行处理，对处理后的小麦秸秆中纤维素及半纤维素的保留量及其酶解转化率进行对比，发现不同浓度NaOH对秸秆产生不同影响。经过NaOH预处理的半纤维素含量不同程度的降低，但酶转化率、可检出纤维素含量均有所提高，证实了NaOH预处理对酶降解作用的必要性。

3 结论

本研究选择不同浓度的NaOH溶液对粉碎后的小麦秸秆进行预处理，确定了β-葡聚糖酶酶法降解小麦秸秆的最佳碱处理浓度为1%，β-葡聚糖酶水解小麦秸秆2h的转化率约为20%；HPLC及FACE检测其寡糖产物主要为纤维二糖。实验证实了碱预处理对酶解反应的必要性及β-葡聚糖酶降解小麦秸秆生成纤维寡糖产物的可行性；为小麦秸秆酶解制备纤维寡糖提供了研究依据。为了提高小麦秸秆的利用率及酶解效率，还需要进一步对酶解条件进行优化研究；对酶解产物进行分离纯化和结构鉴定，以获得酶解产物全部寡糖信息。

[1]NIKO VARGA.Pretreatent of corn stover using wet oxidation to enhance enzymatic digestibility[J].Applied biochemistry and biotechnology，2003，104：37-50.

[2]刘德礼，谢林生，马玉录.木质纤维素预处理技术研究进展[J].酿酒科技，2009（1）：105.

[3]AKPINAR O， MCGORRIN RJ， PENNER M H.Cellulosebased chromatography for cellooligosaccharide production[J].JournalAgriculturalandFoodChemistry，2004，52（12）：4144-4148.

[4]ZHANG Y H，LYND LR.Cellodextrin preparation by mixedacid hydrolysis and chromatographic separation[J].Analytical Biochemistry，2003，322：225-232.

[5]LISA AF，JARRED TB，PETER AP.Isolation，modification and NMR assignments of a series of cellulose oligomers[J].Journal of the American Chemical Society，1999，121：7228-7238.

[6]沈雪亮.功能性纤维低聚糖的研究现状及发展前景[J].食品与发酵工业，2009（8）：100-103.

[7]Jogensen H，Vibe-Pedersen J，Larsen J，et al.Liquefaction of lignocellulose at high-solids concentration[J].Biotechnol Bioeng，2007：96，862-870.

[8]文新亚，李燕松，张志鹏，等.酶解木质纤维素的预处理技术研究进展[J].酿酒科技，2006（8）：97-99.

[9]DeVrijeT， DeHaas GG， Tan GB， et al.Pretreatment of miscanthus forhydrogen production by thermotogaelfiy[J].International Journal of Hydrogen Energy，2002，27 （11/12）：1381-1390.

[10]郭德宪，曹健，曾实，等.里氏木霉纤维素酶降解小麦秸秆的研究[J].粮食与饲料工业，2003（3）：25-27.

[11]Weil J，Westgate P，Kohlmann K，et al.Cellulose pretreatment of lignocellulose substrates[J].Enzyme Microb Technol，1994，16：1002-1004.

[12]AKPINAR O，MCGORRIN RJ，PENNER M H.Cellulosebased chromatography for cellooligosaccharide production[J].JournalAgriculturalandFoodChemistry，2004，52（12）：4144-4148.

[13]T Watanabe.Development of physiological functions of cellooligosaccharides[J].Cellulosecommunication，1998，（5）：91-99.

[14]S Nakamura.Bioavailability of cellobiose and other nondigestible and/or non-absorbable sugar substitutes and related topics[J].Nutrition，2005，21：1158-159.

[15]李嘉喆，林鹿.木质生物质纤维低聚糖制备与分离研究进展[J].江西农业学报，2007（9）：112.

[16]S Nakamura，T Oku，M Ichinose.Bioavailability of celllobiose by tolerance test and breath hydrogen excretion in humans[J].Nutrition，2004，20：979-983.

[17]刘娜，石淑兰，张小英.小麦秸秆转化为可发酵糖的研究[J].可再生能源，2005（3）：21.

[18]Chosdu R，Hilmy N，Erizal Erlinda TB，et al.Radiation and chemical pretreatment of cellulosic waste[J].Radiat PhysChem，1993，42：695-698.

[19]HansenMadsA T，Jogensen H，Felby C，et al.Pretreatment and enzymatic hydrolysis of wheat straw（Triticum aestivum L.）-The impact of lignin relocation and plant tissues on enzymatic accessibility[J].Bioresource Technology，2011，102：2804-2811.