两种松科植物松多酚体外抗氧化活性评价

刘 冉，王振宇，卢 静，欧阳乐

（1.东北林业大学森林植物资源学科，黑龙江哈尔滨 150040；2.东北林业大学食品科学与工程学科，黑龙江哈尔滨150040；3.哈尔滨工业大学食品与工程学院，黑龙江哈尔滨150090）

松多酚是一类天然多酚类物质，是一类最普遍的植物次生代谢产物，在植物正常生长抵御感染和损伤方面都是十分重要的[1-2]，随饮食摄入后，经机体吸收增加了血液抗氧化能力，有助于预防癌症和心脑血管疾病大的发生[3-4]，在营养、健康、医药领域的关注度逐渐增高[5]。机体中的氧化反应和自由基导致了细胞损伤、炎症、肿瘤和心血管疾病的发生，植物多酚作为一种天然抗氧剂能够抑制或者中断氧化进程和平衡机体自由基，从而可以达到预防这些疾病的效果[1，5]。松树皮提取物对于多方面的疾病有一定的治疗作用，特别是对于心脑血管疾病是非常有益的，如舒缓血管和通过调节毛细管渗透率改善微循环[6]。碧螺芷PYC是Pinus pinaster的树皮提取物，现在已经作为一种食品营养补充剂遍及全球，其主要成分有低聚原花青素（65%～75%）、酚酸和花旗松素[7]。通过对一些松科植物[8-10]松树皮提取物研究发现，原花青素是最主要的成分，是由儿茶素和表儿茶素单体通过C4→C8和（或）C4→C6键合连接在一起的低聚体或高聚体[2]。近些年，原花青素受到特别关注，主要是因为他们的药理活性，特别是在抗动脉粥样硬化和清除自由基方面[11]。红松（Pinus koraiensis）、红皮云杉（Picea koraiensis）为松科常绿乔木[12]，是我国重要的珍贵用材树种[13]，目前针对红松和红皮云杉松多酚研究的报道较少。本文以红松和红皮云杉两种松科植物为实验原料，研究树皮松多酚的体外抗氧化活性，进一步对松多酚的成分进行分析对比，为以后松多酚的深入研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

红松树皮、红皮云杉树皮 小兴安岭地区；没食子酸、DPPH、D-脱氧核糖 美国Sigma公司，分析纯；芦丁、原花青素 上海源叶生物科技有限公司，色谱纯；福林酚试剂、硫代巴比妥酸 天津市光复精细化工研究所，分析纯；D101大孔树脂 天津市海光化工有限公司。

FA2004型分析天平 上海精密科学仪器有限公司；KQ-500DE型数控超声波清洗器 湖南星科科技有限公司；RE-52A型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；722型可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1松多酚的提取和富集 精确称取干燥粉碎过40目的脱脂树皮5.00g，用60%乙醇在料液比为1∶30、超声功率为150W、温度为30℃条件下提取三次，过滤，真空浓缩到150mL，得到松多酚粗提液。将松多酚粗提液通过D101大孔树脂进行富集，用60%乙醇洗脱，收集并浓缩洗脱液，得松多酚样品。

1.2.2 还原能力的测定[14]取1mL样品于试管中，依次加入2.5mL 0.2mol/L磷酸盐缓冲液（PBS，pH6.6）和2.5mL 1%铁氰化钾[K3Fe（CN）6]溶液，混匀后于50℃水浴保温20min后，快速冷却，再加入2.5mL 10%三氯乙酸，离心10min，取上清液2.5mL，依次加入2.5mL蒸馏水、0.5mL 0.1%三氯化铁，充分混匀，在700nm下测其吸光度（以蒸馏水作调零空白）。

1.2.3 DPPH·清除能力测定[15]分别取不同浓度的松多酚样品1mL及3mL、1×10-4mo1/L的DPPH溶液加入同一具塞试管中，摇匀后放置30min，以乙醇作参比，分别测定517nm处的吸光度A1。同时测定1mL不同浓度样品与3mL乙醇混合后517nm的吸光度A2，再测定3mL DPPH溶液与1mL乙醇混合液517nm的吸光度A3。根据公式（1）计算DPPH·清除率。以VC作阳性对照。

清除率（%）=[1－（A1－A2）/A3]×1001）/A2]×100 式（1）

1.2.4 羟自由基清除能力测定[16]采用D-脱氧核糖-铁体系法。体系中包含500μL KH2PO4-KOH缓冲溶液、100μL 5mmol/L FeCl3-EDTA混合液、100μL 10mmol/L的脱氧核糖溶液、100μL 10mmol/L的H2O2溶液、100μL 5mmol/L抗坏血酸溶液、100μL不同浓度的样品。于37℃下水浴恒温保持1h。然后加入2.8%三氯乙酸溶液1.00mL，1.0%硫代巴比妥酸溶液1.00mL，混匀后沸水浴中加热10min，冰水冷却后532nm处测定吸光值A1。不加样品测定其吸光值A2。羟自由基清除率计算公式见式（2）。

清除率（%）=（A2－A1）/A2×100 式（2）

1.2.5 酚类物质含量的测定

1.2.5.1 多酚含量的测定 参见文献[17]。

1.2.5.2 黄酮含量的测定 参见文献[18]。

1.2.5.3 原花青素含量的测定 参见文献[19]。

2 结果与分析

2.1 还原能力

图1 还原能力Fig.1 Reducing power

由图1可以看出，红松松多酚、红皮云杉松多酚、VC的还原能力与浓度之间呈现出显著的相关性，相关系数R2分别为：0.9849、0.9907、0.9992。红皮云杉松多酚还原能力略高于红松松多酚，与抗氧化剂VC的还原能力相比，在低浓度0～60μg/mL条件下，松多酚还原能力高于VC，当浓度达到80μg/mL后，VC的还原能力逐渐高于松多酚。由表1可知，红松松多酚、红皮云杉松多酚和VC还原能力的EC50差异显著（p＜0.05），EC50依次为（77.93±0.78）、（68.87±0.52）、（70.17±1.10）μg/mL。研究证实，一些植物提取物的抗氧化能力与还原能力之间具有很好的相关性，因此还原能力可以作为一种衡量抗氧化能力的指标[20]。具有还原能力的物质可以通过提供氢质子将体系中铁离子还原，从而抑制自由基的产生[4]，多酚类物质正是氢质子的提供者，因此松多酚含量越高其还原能力越强。

2.2 DPPH·清除能力

图2 DPPH·清除能力Fig.2 DPPH radical scavenging activity

由图2可知，在浓度0～40μg/mL范围内，两种松多酚清除DPPH·的能力相当，并呈现良好的剂量依赖关系，显示了较强的清除DPPH·的能力，在浓度达到40μg/mL以后，清除率曲线逐渐趋于平缓，红松松多酚对DPPH·的清除能力逐渐高于红皮云杉松多酚。同浓度的条件下，抗氧化剂VC清除DPPH·的能力显著高于松多酚，抗氧化剂VC具有最低的清除DPPH·IC50为（13.72±0.21）μg/mL（表1），最高清除率可达到67.03%。红松和红皮云杉松多酚清除DPPH·IC50分别为（50.49±0.49）μg/mL和（54.67±0.75）μg/mL。DPPH·是一种稳定的自由基，可以接受一个电子或一个质子，形成更稳定的物质。DPPH·清除实验是基于DPPH·接受抗氧剂的一个氢原子使奇数电子的氮原子减少从而引起体系中颜色的降低[17]，抗氧化剂清除DPPH·效果主要依赖于其供氢的能力。实验数据表明，红松和红皮云杉松多酚清除DPPH·能力不及抗氧化剂VC。Van等[21]研究了南欧海松提取物碧螺芷PYC清除自由基的能力，发现碧螺芷PYC清除DPPH·的能力要高于儿茶素单体，证明了在抗氧化方面碧螺芷PYC各种组分之间存在协同增效的作用。两种松科植物松多酚可以有效清除非生理自由基（DPPH·），因此可以猜测松多酚在预防自由基引发的连锁反应方面具有一定的作用[22]。

2.3 羟自由基清除能力

图3 清除羟自由基能力Fig.3 Hydroxyl radical scavenging activity

清除DPPH·的模型是一种有用的检测抗氧化潜能的指标，然而这个模型不是用生物或者食品作为基质，所以对于实际的抗氧化能力预测是受到限制的[23]。因此本研究以羟自由基引发脱氧核糖的损伤降解为基质对松多酚的抗氧化能力进行评价。松多酚清除羟自由基能力如图3所示。两种松多酚清除羟自由基能力具有相同的趋势，浓度在0～15μg/mL范围内，清除羟自由基的能力随着浓度的增大迅速提高，呈显著的剂量依赖关系，但是当浓度达到15μg/mL以后，清除率变化缓慢，清除能力达到了最高限度。松多酚对Fenton反应产生羟自由基引起的脱氧核糖降解显示极强的抑制作用，同浓度的条件下，两种松多酚清除羟自由基的能力相当，红皮云杉松多酚略高于红松松多酚，红皮云杉松多酚清除能力高于红松松多酚，但都强于水溶VE。由表1数据显示，红皮云杉松多酚和红松松多酚具有较低的IC50（1.63±0.02）、（1.66±0.05）μg/mL，显示极强的清除羟自由基的能力。数据表明，松多酚可以抑制由羟自由基损伤引起的脱氧核糖的降解，其原因体现在两个方面，一是松多酚可以直接清除羟自由基，另一方面是松多酚可以阻断Fenton反应，减少了羟自由基的产生量[24]。

2.4 抗氧化活性的IC50（EC50）对比

还原能力、DPPH·清除能力和OH·清除能力的IC50（EC50）值，见表1。

表1还原能力、DPPH·清除能力和OH·清除能力的IC50（EC50）值Table 1IC50（EC50）of reducing power，DPPH·scavenging activity and OH·scavenging activity

注：不同小写字母代表差异显著，p＜0.05。

2.5 抗氧化活性成分分析

图4 红松和红皮云杉树皮中酚类物质含量Fig.4 Phenolic compounds of pine bark of Pinus koraiensis and Picea koraiensis

松多酚是松科植物最主要的一类生物活性物质，本研究对两种松科植物（红松、红皮云杉）树皮中的酚类物质（多酚、黄酮、原花青素）含量进行比较。由图4可知，红松、红皮云杉的树皮总酚和原花青素的含量都较高，而黄酮的含量相对较低。红松树皮酚类物质的含量均显著高于红皮云杉树皮（p＜0.05），红松树皮总酚和原花青素的含量可分别达到（50.18±1.78）mgGAE/g干重和（39.51±0.72）mgGAE/g干重；红皮云杉树皮中总酚和原花青素的含量略低分别为：（38.09±1.38）mgGAE/g干重和（31.73±1.02）mgGAE/g干重。

3 讨论

许多疾病如炎症、缺血-再灌入损伤、动脉硬化、老年痴呆症和帕金森症都与活性氧引起的生物大分子损伤有关，是由自由基生成—清除体系不平衡导致的[25]。多酚抗氧化作用主要是通过直接清除自由基、抑制自由基的形成、激活抗氧化体系、促进机体抗氧化物质的形成和与金属离子螯合途径实现的[26-27]。

对松科植物的研究已证实，松科植物树皮提取物通常含有较高的单体酚和低聚原花青素（黄烷-3-醇聚合物）[28]。原花青素是松多酚的主要组成成分，原花青素的聚合度也是松树提取物最重要的一个性质，一方面影响抗氧化能力，低聚原花青素抗氧化能力随聚合度的增加而增加[29]；另一方面也影响了原花青素的两亲性，Torres等[30]、Gaulejac等[31]研究证明，原花青素聚合度在2～4之间具有极好的两亲性（亲水/疏水性）。

松多酚抗氧化性能主要依赖于分子中含有的酚羟基结构。实验证实邻位酚羟基是抑制氧化过程中的主要还原部位，在抗氧化过程中，邻位酚羟基作为氢供体，捕捉氧化过程中产生的自由基，而自身被氧化成稳定醌类物质，终止自由基引发的氧化进程[32]。在还原能力和DPPH·两个体系中，松多酚表现的抗氧化活性主要依赖于松多酚的供氢能力，红皮云杉松多酚抗氧化活性高于红松松多酚，是由于前者原花青素占总酚的比例高于后者，原花青素B环上的邻位酚羟基是供氢的主要位点。而在羟自由基体系中，松多酚主要通过直接清除羟自由基和阻止羟自由基生成两条途径来达到抑制脱氧核糖降解的作用，在这个体系中红松松多酚抗氧化活性高于红皮云杉松多酚，其原因可能是红松松多酚中原花青素与酚酸、黄酮之间的协同增效作用效果强于红皮云杉松多酚。

4 结论

两种松科植物（红松和红皮云杉）树皮松多酚体外抗氧化活性实验结果表明，红松松多酚和红皮云杉松多酚具有较高的还原能力，可以有效地清除生理和非生理自由基（OH·、DPPH·）。还原能力和清除羟自由基的能力红皮云杉松多酚活性强于红松松多酚，清除DPPH·能力红松松多酚活性高于红皮云杉松多酚，结果表明，红松和红皮云杉树皮松多酚是潜在的抗氧化剂和自由基清除剂。树皮中酚类物质（总酚、原花青素、黄酮）含量测定结果显示，两种树皮中总酚和原花青素含量较高，黄酮的含量相对较低，红松树皮的酚类物质含量显著高于红皮云杉树皮（p＜0.05）。原花青素是松多酚的重要组成成分，其含量和结构是影响松多酚抗氧化活性最主要的因素，此外松多酚各组分酚酸、黄酮和原花青素之间存在协同增效作用。

根据本课题的研究，松多酚具有较强的抗氧化活性，因此可以作为一种新的天然抗氧化剂，广泛应用在食品、化妆品、保健品和医药领域；红松和红皮云杉两种松科植物的树皮中富含多酚和原花青素，因此可以作为多酚和原花青素资源的重要来源。本研究只是对红松和红皮云杉两种松科植物中松多酚的体外抗氧化活性和松多酚组分进行了初步的比较分析，为以后松多酚的深入研究奠定基础。在以后研究过程中，进一步对松多酚的具体组成成分、原花青素的组分单位和聚合度进行分析，在抗氧化活性方面，体外与体内实验相结合，验证松多酚可以通过激活抗氧化体系、促进机体自身抗氧化物质形成与金属离子螯合等途径达到抗氧化的目的，进而阐明松多酚的抗氧化机制。

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