妇痛定颗粒质量标准测定

汤小蕾

(浙江医药高等专科学校,浙江宁波315100)

妇痛定颗粒由黄芪、当归、延胡索等组成,最早来源于古方“三神丸”,后通过临床应用的增减衍化而来,具有补血益气、活血通络、调经止痛的功效,可用于气血不足引起的各种痛经、闭经、月经不调等证,临床疗效显著。本文通过正交实验确定其最佳提取工艺,并参照《中国药典》2010版一部,采用高效液相色谱和蒸发光检测器测定妇痛定颗粒中黄芪的活性成分黄芪甲苷,采用高效液相色谱紫外检测器测定延胡索乙素,以建立该药的质量标准。

1 试验材料

Waters2695系列高效液相色谱仪(美国Waters公司),EMPOWER化学工作站,2487双通道紫外可变波长检测器,蒸发光散射检测器(Altech 2000),Agela C18色谱柱(5 μ m,250 mm ×4.6 mm),Sartorius CP225D 型电子天平(美国Sartorius公司),DK-S22型电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司),DHG-9053A电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)。妇痛定颗粒样品(批号:110901、110902、110903),由宁波远志生物科技有限公司提供;黄芪甲苷对照品(批号0789-201028,供含量测定用),延胡索乙素对照品(批号0881-201118,供含量测定用)购自中国药品生物制品检验所;薄层层析硅胶G板(青岛海洋化工厂);甲醇为色谱纯(美国Sigma-Aldrich公司),磷酸为分析纯,水为超纯水,其余试剂均为分析纯。

2 薄层鉴别

2.1 黄芪薄层色谱鉴别 取本品10 g,研成细粉,加甲醇40 mL,超声处理30 min,过滤,取续滤液蒸干,残渣加水 20 mL使溶解,用正丁醇萃取3次,每次20 mL,合并正丁醇萃取液,用氨水洗涤2次,每次30 mL。弃去氨水溶液,再用水洗涤3次,每次50 mL,弃去水液,正丁醇液蒸干,残渣加甲醇1 mL溶解即得供试品溶液。另按处方量的药材及辅料除去黄芪同法制成缺黄芪的阴性样品溶液。取黄芪甲苷对照品,加甲醇制成每1 mL含1 mg的对照品溶液。吸取上述溶液各5 μ L,分别点于同一硅胶G薄层板上,以氯仿—醋酸乙酯—甲醇—水(15∶40∶20∶10)10 ℃下放置的下层溶液为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色清晰。结果显示,供试品色谱中与黄芪甲苷对照品在相同位置上显相同颜色的斑点,而阴性对照品无干扰。

2.2 当归的薄层色谱鉴别 取本品5 g,研细粉,加乙醚20 mL,超声处理20 min,过滤,取续滤液蒸干,残渣加乙醇1 mL溶解得供试品溶液。另按处方量的药材及辅料除去当归同法制成缺当归的阴性样品溶液。取当归对照药材0.5 g,同法制成对照药材溶液。吸取上述溶液各10 μ L,分别点于同一硅胶G薄层板上,以正己烷-乙酸乙酯(4∶1)为展开剂,展开,取出,晾干,至紫外光灯(365 nm)下检视。结果显示,供试品色谱中与当归对照药材在相同位置上显相同颜色的斑点,而阴性对照无干扰。

2.3 延胡索乙素的薄层色谱鉴别 取本品10 g,研细粉,加甲醇30 mL,超声处理30 min,过滤,取续滤液蒸干,残渣加水20 mL使溶解,用浓氨水调节pH至10～11,加乙醚萃取2次,每次20 mL,合并乙醚液,蒸干,残渣加甲醇1 mL溶解得供试品溶液。另按处方量的药材及辅料除去当归同法制成缺当归的阴性样品溶液。取延胡索乙素对照品,加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液,作为对照品溶液。吸取上述溶液各5 μ L,分别点于同一硅胶G 薄层板上,以正己烷-丙酮(8∶2)为展开剂,展开,取出 ,晾干,碘蒸气熏3 min,取出,挥尽碘后,置紫外光灯(365 nm)下检视。结果显示,供试品色谱中与延胡索乙素在相同位置上显相同颜色的斑点,而阴性对照无干扰[4]。

3 含量测定

3.1 延胡索乙素的含量测定

3.1.1 溶液制备 对照品溶液制备:精密称定胡索乙素对照品适量,加流动相制成每1mL含15 μ g的溶液。供试品溶液制备:精密称取本品3 g,研细,加入甲醇25mL。称定重量,回流30 min,加甲醇补足失去的重量,滤过,精密吸取续滤液 15 mL,蒸干,残渣加水20 mL使溶解,用氨水调节pH到9～10,加石油醚(60～90℃)振摇提取4次,每次20 mL,合并提取液,蒸干,残渣加甲醇溶解,并转移到10 mL容量瓶中,加甲醇至刻度,即得。阴性样品溶液:另按处方量的药材及辅料除去当延胡索同制成缺当归的阴性样品,再同“供试品溶液制备”项下方法操作,即得。

3.1.2 色谱条件 采用Agela C18(5 μ m,250 mm×4.6 mm)色谱柱,以甲醇—0.1%磷酸溶液(用三乙胺调节 pH至 5.0)(60∶40)为流动相;检测波长为280 nm,进样量10 μ L。理论板数按延胡索乙素峰计算应不低于2 000。

3.1.3 线性范围的考察 精密称取延胡索乙素对照品5.1 mg,置25 mL量瓶中,加甲醇使溶解并稀释至刻度,摇匀,再从中分别取1.5,3,4.5,6,7.5 mL分别置于10 mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀。分别吸取上述各溶液10 μ L注入液相色谱仪,测定峰面积。以峰面积积分值(Y)为纵坐标,对照品进样量(X)为横坐标,得延胡索乙素的回归方程为:Y=489.2X-2 136.6,r=0.999 4。结果表明:延胡索乙素在0.061 1～0.308 μ g范围有良好的线性关系。

3.1.4 精密度试验 精密吸取对照品溶液各10 μ L,连续进样6次,结果延胡索乙素峰面积的RSD(n=6)为1.9%。

3.1.5 稳定性试验 精密吸取供试品溶液(批号:110901)10 μ L,按上述色谱条件分别于0,1,2,4,8,24 h进样测定峰面积。结果延胡索乙素峰面积的RSD(n=6)为1.2%。

3.1.6 重复性试验 取样品(批号110901),分别取6份,每份约3 g。照“3.1.1.2”项下方法处理得供试品溶液,依上述色谱条件进样测定含量。结果样品中延胡索乙素的平均含量(n=6)为0.101 4 mg/g,RSD为0.9%。

3.1.7 回收率试验 取“3.1.7”项下的细粉 9份,每份1.5～2.5 g(含延胡索乙素为0.101 4 mg/g),精密称定。分别精密加入延胡索乙素对照品适量,照“3.1.1.2”项下方法处理得供试溶液,依上述色谱条件进样测定,计算延胡索乙素平均回收率(n=9)为98.85%,RSD为1.7%。

3.1.8 样品测定 精密吸取供试品溶液和对照品溶液各10 μ L,依上述色谱条件测定,每袋样品测定3份,以外标法计算含量,取其含量平均值,见表1。

表1 样品含量测定结果 mg/袋

3.2 黄芪甲苷的含量测定

3.2.1 溶液制备 对照品溶液制备:取黄芪甲苷对照品适量,精密称定,加流动相制成每含量为0.196 0 mg/g的溶液,即得。供试品溶液制备:取本品10袋的内容物,研细。取细粉约5.0 g,精密称定,置索氏提取器中,加甲醇50 mL,冷浸过夜,再加甲醇适量,加热回流提取4 h,提取液回收甲醇并浓缩至干,残渣加水10mL微热使溶解,加水饱和的正丁醇振摇提取4次,每次40 mL,合并正丁醇液,用氨试液充分洗涤2次,每次40 mL,氨试液弃去,正丁醇液水蒸干,用甲醇溶解并转移至5 mL量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,用0.45 μ m微孔薄膜过滤,取续滤液作为供试品溶液[3-5]。阴性样品溶液:另按处方量的药材及辅料除去当黄芪同制成缺当归的阴性样品,再同“供试品溶液制备”项下方法操作,即得。

3.2.2 色谱条件 色谱柱:Prodigy 5u C18色谱柱(250 mm ×4.6 mm,5 μ m),流动相 :乙腈-水(35∶65),流速:1.0 mL/min,柱温:24℃。ELSD参数:飘移管温度100℃,氮气流速1.5 mL/min。

在上述条件下,黄芪甲苷与样品中其它组分色谱峰可达基线分离,其分离度大于1.5,理论塔板数按黄芪甲苷峰计算在4 000以上。

3.2.3 线性范围的考察 分别精密吸取对照品储备液4,6,8,10,16,20 μ L进样,测定其峰面积积分值,以进样量的对数为横坐标,峰面积积分值的对数值纵坐标,绘制标准曲线,得黄芪甲苷的回归方程为:Y=1.69X-7.54,r=0.999 6。结果表明黄芪甲苷在进样量2.041～10.202 μ g范围内线性关系良好。

3.2.4 精密度试验 精密吸取同一对照品溶液20 μ L,重复进样 6次,测定其峰面积积分值,其相对标准偏差RSD(n=6)为 1.59%,表明仪器精密度良好。

3.2.5 稳定性试验 分别精密吸取同一供试品溶液20 μ L,于 0、1 、2、4、8、24 h 进样,测定其黄芪甲苷峰面积积分值,其相对标准偏差RSD(n=6)为1.42%。结果表明供试品溶液至少在24 h内较为稳定。

3.2.6 重复性试验 取同一批号样品(批号:110901)约5.0 g,共6份,按上述条件,测定其黄芪甲苷含量。结果平均含量为0.196 0 mg/g,其相对标准偏差RSD为2.67%。

3.2.7 回收率试验 精密称取已知含量的样品(含量为0.196 0 mg/g)约2.5 g 9份,置索氏提取器中,分别精密加入黄芪甲苷对照品溶液(0.50 mg/mL)9.0,10.0,11.0 mL各2份,然后按上述方法制备供试品溶液,并测定含量,计算回收率,平均回收率为98.10%,RSD为0.87%。

3.2.8 样品测定 精密吸取供试品溶液和对照品溶液各10 μ L,按上述色谱条件测定3批样品中黄芪甲苷的含量,取其含量平均值,结果见表2。

表2 3批样品含量测定结果 mg/g

4 小结

黄芪甲苷成分在紫外条件只有末端吸收,最大吸收波长为200.8 nm。如用紫外检测,试剂对分析影响很大。同时薄层色谱扫描法的分离效果也不理想,稳定性和重现性相对较差且操作繁琐。黄芪药材质量标准目前文献报道以及《中国药典(2005年版)》均采用蒸发光散射检测法进行定量分析。ELSD检测器为质量型检测器,不受外部环境干扰,试剂在检测器中全部蒸发,检测灵敏度、稳定性及重复性能够符合含量测定的要求,且操作简便,是一种检测制剂中黄芪甲苷成分的有效分析方法。另实验中发现外界温度变化会影响检测结果,造成出峰时间漂移,电压变化也会引起基线不稳等情况。

根据上述3批样品的含量测定结果,计算3批样品含量平均值为0.212 3 mg/g,即2.123 0 mg/袋,考虑到实际大生产中提取转移率及损耗等问题,按平均含量的80%折算,则含量限度可暂定为本品每袋含黄芪甲苷含量应不得低于1.70 mg。

[1]窦志英,孙巍,田丽莉,张敏.HPLC法比较延胡索生品与不同炮制品中3种有效成分的含量[J].中药材,2007(4):40-42.

[2]赖昌生.延胡索酒醋双制法[J].吉林中医药,2005,25(4):69-72.

[3]王敏,李翔,王逢春.黄芪及相关药材HPLC-ELSD色谱指纹图谱研究[J].华北国防医药,2010(1):88-90.

[4]颜晓航.黄芪及其制剂中黄芪甲苷含量测定方法研究进展[J].安徽医药,2006(12):102-103.

[5]欧阳春华.黄芪甲苷含量测定几种常用方法的比较[J].中国现代药物应用,2009(15):356-357.