急性心肌梗死后TGF-β1/Smad3通路的表达及活血化瘀中药的干预

赵海滨,张秀静,王 帅,郭 梦,马 迪,许晓英

(北京中医药大学第三附属医院,北京100029)

急性心肌梗死(AMI)后的心肌重塑与心脏破裂、室壁瘤形成及心力衰竭等严重并发症密切相关,在AMI死亡率及预后中起至关重要的作用[1]。根据有关实验表明:TGF-β1/Smads信号通路的过度激活在诱发并加重AMI后心肌重塑病理过程中居关键地位[2]。活血化瘀法以中医“祛瘀血、生新血”为理论基础,对AMI后心肌重塑疗效肯定,本课题组通过研究活血化瘀中药对TGF-β1/Smad3通路的影响,探讨活血化瘀法对急性心梗后心肌重塑的效应机制,为活血化瘀法治疗急性心梗后心肌重塑提供实验依据。

1 实验材料

成年清洁级Wistar大鼠50只,体质量(250±10)g,由北京中医药大学东直门医院动物实验中心提供,合格证明:0240574;试剂用药血塞通软胶囊由昆明圣火制药有限责任公司提供,批号:Z19990022;AMD3100(基质细胞衍生因子-1受体阻断剂),由北京启维益成科技有限公司提供,批号:239820-5MG;总RNA试剂提取盒由康为世纪提供;5×SYBRGreen PCRMaster Mix为AB Applied Biosystems公司产品,dNTP为Solarbio公司产品,OligodT、Rnasin、M-MLA 为 promega公司产品,引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成;采用AgilentTechnologiesstratagene M×3 000 P荧光定量仪。

2 实验方法

2.1 动物模型制作 用随机数字表法将大鼠分为正常组、假手术组、模型组、活血化瘀组、AMD3100组,每组10只,分笼饲养。

模型组:参照文献[3-4]制备AMI大鼠模型,盐酸戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔注射麻醉,经口气管插管行小动物呼吸机辅助呼吸,有氧正压通气,潮气量5～6 mL,呼吸比1∶2,呼吸频率80次/min。连接标准12导联,记录大鼠心电图。经左前胸廓旁第3,4肋间逐层开胸,暴露心脏,分离心包,在肺动脉圆锥和左心耳交界处用5～0号丝线结扎左冠状动脉前降支(LAD)近端制成心肌梗死模型,以心电图出现坏死性Q波判断为可能心肌梗死,若无病理性Q波,则再次结扎,以提高心肌梗死模型成功率,然后逐层缝合心腔,术后常规抗感染治疗。

活血化瘀组:制备AMI大鼠模型,术后立即灌胃给药,给药量按《药理实验方法学》所示剂量换算法计算[5]:200 g大鼠计量(g/kg)=人的剂量1g/(kg·d)×0.018。每天灌胃1次,共用7 d。

AMD3100组:制备AMI大鼠模型,第6天腹腔注射AMD3100(5 mg/kg),余同模型组大鼠。

假手术组:大鼠经历上述手术过程,丝线从冠状动脉下穿过但不结扎。

正常组:不做造模处理。

2.2 实时荧光定量PCR检测各组心肌组织TGF-β1mRNA、Smad3mRNA表达水平 1)心肌组织总RNA的提取,心腔内注射10%氯化钾使心脏停跳于舒张期,迅速取下心脏,去除心房大血管及心脏外结缔组织,冲洗干净,分别置于液氮中保存。余下左室用4%多聚甲醛固定,石蜡包埋。在冰块上切取50～100 mg的心肌组织块,采用试剂盒提取组织的总RNA,操作按说明进行。A260/A280=1.8～2.0,并计算出RNA含量。2)cDNA的合成,RNA样品取10 μ g,依次加入 5 ×RT buffer 5μ L,Olig o(dT)1 μ L,NTP 1 μ L,RNA sin 1 μ L,M-MLA 反转录酶1 μ L,无 RNase 水补足至总体积 25 μ L。反应条件:42 ℃1 h;95 ℃15 min,4℃10 min。得RT终溶液即为cDNA溶液。3)实时定量PCR,每种组织均以TGF-β1mRNA 和β-actin基因引物进行定量PCR反应,每管设3个复孔,在96孔PCR板中进行。TGF-β1引物序列:上游引物5’-GTGTGGAGCAACATGTGGAACTCTA-3’,下游引物 5’-TTGGTTCAGCCACTGCCGTA-3’,产物 143 bp。Smad3上游引物 5’-GTCAACAAGTGGTGGCGTGT G-3’,下游引物5’-GCAGCAAAGGCTTCTGGGATAA-3’,产物 150 bp。内参 β-actin引物序列:上游引物 5’-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3’, 下游引物 5’-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3’,产物150 bp。反应条件:95 ℃,10 s;95℃,30 s;55℃,30 s,共40个循环。每一例样本反应结束后由计算机自动计算并读出定量结果Ct值,Ct值采用2-△△Ct法进行相对定量。

2.3 病理形态学检查 于上述各组处死大鼠,取心肌组织,用4%多聚甲醛固定,石蜡包埋,切片HE染色。常规HE染色在光镜下进行病理观察。

2.4 非梗死区胶原蛋白测定 采用Mallory’s Trichrome染色法测定非梗死区胶原含量,心肌呈红色,胶原呈蓝色。显微镜下每张切片随机选取8个非血管区视野,应用计算机图象分析软件IPWin32采图系统进行图片采集,计算机图象分析软件Imageproplus 6.0以相对着色面积进行定量分析,取8个视野的平均值。

2.5 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件,采用单因素方差分析t检验。所得数据均用均数±标准差±s)表示,以P<0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 心肌组织病理学观察 HE染色结果显示,正常组大鼠心脏组织切片,心肌细胞为短柱状,每个心肌细胞有个圆形的核,位于细胞中央呈蓝色,有的细胞为双核结构;细胞核的两端肌浆较多,细胞质呈红色;心肌细胞有分枝,彼此相连成网,排列紧密;心肌细胞分层或分成许多束,且在心肌层或心肌束之间,有结缔组织和毛细血管,有呈红色的血细胞分布;整体呈现正常心肌膜组织。

假手术组大鼠心脏组织切片,心肌细胞为短柱状,每个心肌细胞有个圆形的核,位于细胞中央呈蓝色,有的细胞为双核结构;细胞核的两端肌浆较多,细胞质呈红色;心肌细胞有分枝,彼此相连成网,排列紧密;心肌细胞分层或分成许多束,在心肌层或心肌束之间,有结缔组织和毛细血管,有呈红色的血细胞分布;有成纤维细胞排列存在,其核圆形或杆状呈蓝色;整体呈现正常心肌膜组织。

模型组大鼠心脏组织切片,心肌细胞为短柱状或圆形且个大,数量较少且散在;每个心肌细胞有个圆形的核,位于细胞中央或边沿呈蓝色,有的细胞为双核结构;细胞核的两端或周围肌浆较多,细胞质呈红色。结缔组织整片广布,炎性细胞聚集,核大圆形蓝色,细胞质较少;成纤维细胞多,扁平状结构,核扁卵圆形蓝色,胞质呈粉红色;浅粉红色胶原成分较多;小动脉个大,内皮及平滑肌形态清晰;可见毛细血管和淋巴管结构。整体呈现心肌梗死(重症)心肌膜组织。

活血化瘀组大鼠心脏组织切片,心肌细胞为短柱状,每个心肌细胞有个圆形的核,位于细胞中央呈蓝色,有的细胞为双核结构;细胞核的两端肌浆较多,细胞质呈红色;心肌细胞有分枝,彼此相连成网,排列疏松。心肌细胞间有大量炎性细胞聚集,核大圆形蓝色,胞质少;心肌细胞间还有少量成纤维细胞散在,扁平状结构,核扁卵圆形蓝色,胞质呈粉红色。整体呈现心肌炎心肌膜组织。

AMD3100组大鼠心脏组织切片,心肌细胞为短柱状,每个心肌细胞有个圆形的核,位于细胞中央呈蓝色,有的细胞为双核结构;细胞核的两端肌浆较多,细胞质呈红色;心肌细胞有分枝,彼此相连成网,排列疏松,心肌细胞间结缔组织充斥且与整片结缔组织相连。有结缔组织整片占据切片较大区域,炎性细胞散在,核大圆形蓝色,胞质少;成纤维细胞多,扁平状结构,核扁卵圆形蓝色,胞质呈粉红色;浅粉红色胶原成分较多;红细胞聚集且多。整体呈现心肌梗死(轻症)心肌膜组织。

3.2 非梗死区胶原蛋白测定 结果显示:模型组与假手术组相比较,非梗死区胶原沉积明显(P<0.05),活血化瘀组与模型组相比较胶原沉积降低(P<0.05),见表1。

表1 各组非梗死区胶原蛋白测定结果(±s,n=10)

表1 各组非梗死区胶原蛋白测定结果(±s,n=10)

注:与假手术组比较,△P<0.05;与模型组比较,#P<0.05。

组 别 胶原蛋白含量/%假手术组 3.42±0.47模型组 6.03±0.54△活血化瘀组 5.10±0.36#AMD3100组 5.06±0.27#

3.3 实时荧光定量PCR检测 结果显示:模型组与假手术组相比,TGF-β1mRNA、Smad3mRNA表达均增加(P<0.05)。活血化瘀组较模型组TGF-β1mRNA、Smad3mRNA表达有所降低(P<0.05)。活血化瘀组与AMD3100组相比较 TGF-β1mRNA、Smad3mRNA 差异无统计学意义(P>0.05),见表2。

表2 各组心肌组织TGF-β1mRNA、Smad3mRNA实时荧光定量结果(±s,n=10)

表2 各组心肌组织TGF-β1mRNA、Smad3mRNA实时荧光定量结果(±s,n=10)

注:与假手术组比较,△P<0.05;与模型组比较,#P<0.05。

组 别 TGF-β1 Smad3假手术组 0.86±0.03 0.43±0.07模型组 1.12±0.12△ 1.07±0.13△活血化瘀组 0.97±0.06# 0.86±0.11#AMD3100组 0.95±0.01# 0.82±0.02#

4 讨论

西医学治疗AMI后心肌重塑,主要使用粒细胞集落刺激因子、AMD3100、粒巨细胞集落刺激因子等作为心肌梗死后干细胞“归巢”的有效动员剂,相关研究表明治疗AMI后心肌受损的有效性确切。本实验证实AMD3100治疗AMI后心肌受损的有效性。

中医学认为,心肌梗死属中医“胸痹”“真心痛”的范畴,表现为本虚标实[6],是血道闭塞,血脉不通,瘀血滞塞脉络所致,以“血气不至”“血凝而不流”“血瘀滞不行”等为主要病理机制,以胸闷胸痛、心悸气短等为主要症状。本实验通过祛瘀生新法对大鼠急性心梗后心肌重塑的作用及对TGF-β1/Smads通路的干预发现,祛瘀生新组较模型组TGF-β1mRNA、Smad3mRNA表达有所降低(P<0.05),而Smad7mRNA表达增加(P<0.05),胶原含量明显降低(P<0.05),心肌组织损伤也有所减轻。本实验证实中医祛瘀生新法对急性心梗后心肌重塑有一定抑制作用,这为防治心肌梗死后心肌重塑的中医药治疗研究提供实验依据。

本研究结果表明:TGF-β1/Smads通路作为关键调控因子参与心肌梗死后的心肌重塑过程,祛瘀生新中药可能通过对其表达的活化调控,从而有效改善心肌梗死后的心肌重塑。其作用机制可能是:祛瘀生新中药对TGF-β1mRNA、Smad3mRNA表达的负性调节作用,同时增加Smad7mRNA的表达。至于祛瘀生新法是否还有其他的活化调控机制,还有待进一步深入研究。

[1]Weir RA,Clements S,Steedman T,et al.Plasma TIMP-4 Predicts Left Ventricular Remodeling After Acute Myocardial Infarction[J],Card Fail,2011,17(6):465-471.

[2]张海啸,史载祥.转化生长因子-β信号传导通路与心肌纤维化[J].中日友好医院学报,2007,21(2):110-112.

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[5]徐叔云,卞如濂,陈修.药理实验方法学[M].3版.北京:人民卫生出版社,2001:202-204.

[6]陆孝成.中西医结合临床治疗冠心病[J].吉林中医药,2011,31(4):307.