附子生物碱分布规律研究

孙 凯,李 佳,2,张永清,2＊

(1.山东中医药大学药学院,山东济南250355;2.山东省高校中药资源学重点实验室,山东济南250355)

附子为毛茛科植物乌头Aconitum carmichaelii Debx.的子根的加工品,始载于《神农本草经》。味辛、甘,大热,有毒;归心、肾、脾经;具有回阳救逆、补火助阳、散寒止痛等功效;用于亡阳虚脱,肢冷脉微,心阳不足,胸痹心痛,虚寒吐泻,脘腹冷痛,肾阳虚衰,阳痿宫冷,阴寒水肿,阳虚外感,寒湿痹痛等症。现代研究发现,附子含有多糖、脂类、醇胺、生物碱等成分,具有强心、抗炎、镇静、降糖等活性,并能兴奋垂体—肾上腺皮质系统[1],用于治疗心力衰竭、胸痹等疾病[2-3]。在生物碱类成分中以双萜类生物碱最为重要,如乌头碱、次乌头碱、新乌头碱等,它们既是活性成分又是毒性成分[4],为保证附子饮片质量需要将其含量控制在一定范围内。产地加工与炮制是影响附子中生物碱含量的重要环节,从而对其饮片质量有着非常重要的影响[5]。附子传统加工工艺加工的商品附子多达11个规格,除《中国药典》品种黑顺片、白附片、淡附片、炮附片以外,还有熟附片、挂片、黄附片、刨附片等[6]。其中有的去皮,有的不去皮。不同加工炮制品中,生物碱类成分含量具有明显差异。探讨附子中生物碱类成分的组织分布状况,对于确定适宜的加工炮制方法、有效控制附子饮片质量具有重要意义。

1 实验材料

1.1 仪器 FW-100高速万能粉碎机(北京永光明医疗仪器厂);电热恒温水浴锅(北京医疗设备厂);101C-Z型干燥箱(上海市实验仪器厂);四元泵,在线脱气机,手动进样器,Agilient Chem Station色谱工作站,TC-C18柱(5 μ m,4.6 mm×250 mm),紫外吸收检测器;微孔滤膜;FA 1004型电子天平(上海精密科学仪器有限公司);AGB5型电子天平(美国METTLER TOLEDO公司);电热恒温水浴锅(北京科伟永鑫仪器厂);KQ-250E医用超声波清洗器(昆山市超声波仪器有限公司)。

1.2 试剂 娃哈哈纯净水;甲醇(一级色谱纯,天津四友精细化学品有限公司)、乙腈(一级色谱纯,Tedia Company,INC.1000 Tedia Way,Fairfield,OH 45014 USA);标准品:乌头碱(302-27-2)、新乌头碱(2752-64-9)、次乌头碱(6900-87-4)均为上海源叶生物科技有限公司生产,纯度≥98%。其余试剂,均为国产、分析纯。

1.3 药材 上海康桥中药饮片有限公司提供,2012年7月采集自四川省江油市,经山东中医药大学周凤琴教授鉴定,确认为毛茛科植物乌头 Aconitum carmichaeli Debx.的子根,鲜品。取子根适量,用刀片从外向内依次将表皮与皮层、韧皮部、木质部、髓等组织分开,分别编号为H1、H2、H3、H4;从顶端到底端平均分成9 部分,分别编号为 Z1 、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z7、Z8、Z9。将分离后的各个部分,晒干,以粉碎机粉碎,过60目筛,置干燥器中备用。

2 实验方法

2.1 供试品溶液制备 取干燥粉碎后的药粉约2 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,加10%氨水3 mL,精密加入异丙醇-乙酸乙酯(1∶1)的混合溶液50 mL,称定重量,超声提取30 min,放冷,再称定重量,用异丙醇-乙酸乙酯(1∶1)混合溶液补足减失重量,摇匀,滤过。精密量取续滤液25 mL,40℃以下减压回收溶剂至干,残渣精密加入异丙醇-三氯甲烷(1∶1)的混合溶液3 mL溶解,滤过,滤液转移至10 mL容量瓶中,定容并摇匀,过0.45 μ m滤膜,作为供试品溶液备用。

2.2 色谱条件 色谱柱:十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱C18(ODS,250 mm ×4.60 mm,5 μ m);检测波长 :240 nm;流速:1.0 mL/min;进样量:20 μ L 。流动相梯度洗脱条件,见表1。

表1 进样梯度洗脱程序

2.3 方法学考察

2.3.1 标准曲线与线性关系 精密称取乌头碱、新乌头碱和次乌头碱标准品各10 mg,置10 mL容量瓶中,加0.05%盐酸-甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,作为对照品贮备液A、B、C,浓度为1.0 mg/mL,分别稀释配成 0.8 mg/mL、0.6 mg/mL、0.4 mg/mL、0.2 mg/mL的溶液,作为对照品线性溶液,精密吸取对照品溶液各 20 μ L,按“2.2”项色谱条件进行测定 ,以峰面积与浓度进行回归,得到乌头碱、新乌头碱、次乌头碱在0.1～1.0 mg/mL浓度范围内的标准曲线方程,线性关系良好,相关系数均在0.999以上,见表2。

表2 回归方程、相关系数和线性范围

2.3.2 精密度试验 精密吸取S6溶液各20 μ L,按“2.2”项下色谱条件连续进样6次,测定峰面积,RSD=1.92%(n=6),表明仪器精密度良好。

2.3.3 重复性试验 按“2.1”项下操作,制备6份S6供试品溶液 ,按“2.2”项下色谱条件各进样 20 μ L,测定峰面积,RSD=2.74%(n=6),表明重复性良好。

2.3.4 稳定性试验 精密吸取S6溶液各20 μ L,分别于0,2,4,6,8,12 h各进样1次,测定峰面积,RSD=1.33%(n=6),表明样品溶液在12 h内稳定性良好。

2.3.5 加样回收试验 精密称取已知含量的S6号样品6份,各0.5 g,分别精密加入乌头碱、新乌头碱和次乌头碱对照品适量,按“2.1”项下制备样品溶液,按“2.2”项下色谱条件测定峰面积。分别进样3次,根据公式(C-A)/B×100%计算,结果平均加样回收率为94.53%,RSD=1.84%,表明具有较好回收率。

2.4 样品含量测定 取各样品溶液,按“2.2”项下色谱条件测定,记录新乌头碱、乌头碱、次乌头碱的峰面积,根据各生物碱标准曲线计算其含量。每样品重复3次。

3 结果与分析

3.1 生物碱在附子中的横向分布 将附子由外向内大体将表皮与皮层、韧皮部、木质部及髓部分开,经测定,其乌头碱、新乌头碱和次乌头碱含量如表3所示。

表3 附子中生物碱的横向分布情况

表3结果显示,新乌头碱、乌头碱与次乌头碱在附子各组织中的分布状况是不一样的,新乌头碱、次乌头碱及总生物碱均以韧皮部含量最高、表皮与皮层含量最低,而乌头碱却以髓部含量最高、韧皮部含量最低。

3.2 生物碱在附子中纵向分布 用刀片将附子从顶端至底端分割为9个部分,分别测定其生物碱含量,结果如表4所示。

表4 附子中生物碱的纵向分布情况

表4结果显示,附子从顶端至底端新乌头碱、乌头碱含量最高的部位分别为第2节段、第9节段,次乌头碱、总生物碱含量最高的部位为第1节段,新乌头碱含量最低的部位为第5节段,乌头碱、次乌头碱及总生物碱含量最低的部位均为第4节段。各种生物碱含量变化的大体趋势均表现为先降低后升高再降低。

4 小结

生物碱属于植物次生代谢物质,其合成与积累与植物体内的生理生化代谢活动密切相关。一般来讲,代谢越旺盛的部位,次生代谢物质合成与积累的越多,含量越高。本实验结果显示,次乌头碱、新乌头碱、乌头碱及总生物碱在附子中的分布具有一定的规律性。在横向上,以韧皮部含量最高,表皮与皮层含量最低;在纵向上,上端含量最高,往下不断降低,然后又有升高和降低,直径最大部位的生物碱含量较低。附子生物碱分布的规律性,决定于根部生理生化代谢活动。韧皮部具有输导有机物质的作用,其代谢活动强烈,所以其中的生物碱含量较高。表皮、皮层、木质部、髓部死亡细胞较多或发挥贮藏功能,代谢强度相对较低,所以其生物碱含量较低。根部上端是母根相连处,各种维管束比较集中,代谢活动强,生物碱含量高。在中部直径较大的部位,贮藏组织发达,其皮层与髓部所占比例相对较大,所以生物碱含量偏低。根部下端贮藏组织减少,微管组织相对发达,所以其含量又有升高。根部末端表皮与皮层所占比例增大,使得生物碱含量再次降低。掌握附子生物碱分布规律,可为选择加工炮制方法、控制饮片质量提供参考,如去除子根顶端和低端、去皮时深达木质部等均可以有效降低生物碱含量。

[1]国家药典委员会.中国药典[M].北京:中国医药科技出版社,2010:177-178.

[2]张卫东,韩公羽,梁华清,等.国内外对中药附子成分与活性的研究[J].药学实践杂志,1996,14(2):91-94.

[3]贾志杰.谈附子临床应用的安全性[J].吉林中医药,2010,30(2):170-171.

[4]孙连英.中药附子的临床功用[J].吉林中医药,2003,23(5):48.

[5]邹文清.附子的临床运用举偶[J].吉林中医药,2005,25(4):39-40.

[6]阴健,郭力弓.中药现代研究与临床应用[M].北京:学苑出版社,1994:382-383.

[7]赵纳,侯大斌,刘向鸿.不同炮制方法对附子中乌头总碱和双酯型生物碱含量的影响[J].中药材,2011,34(1):39-42.

[8]陈彦琳,杜杰,梁焕,等.道地药材附子炮制加工规范化探讨[J].中国现代中药,2009,11(7):42-43.