重 结 晶 法 制 备 次 氯 血 红 素

修志明, 林 琳, 周 朋, 王丽萍

(1. 吉林大学 生命科学学院, 长春 130012； 2. 北华大学 药学院, 吉林 吉林 132013；3. 海南大学 农学院, 海口 570228)

自然界中许多天然过氧化物酶均以血红素(Heme)作为辅基, 通过血红素卟啉环的Fe3+与组氨酸侧链基团上N原子配位构成酶的催化中心[1-2]. 由于血红素上的乙烯基易被过氧化物氧化而影响酶的稳定性, 因此在设计过氧化物模拟酶时,可将血红素转化为次血红素[3]. 次氯血红素(Deuterohemin)属于三价铁卟吩衍生物, 化学名称为3,7,12,17-四甲基-21H,23H-卟吩-2,18-二丙酸氯化铁, 分子式为[C30H28FeN4O4]+Cl-, 分子量为599.87. 以次氯血红素分子为基础设计的次氯血红素-短肽化合物研究和应用目前已有较多报道[4-14].

通常利用间苯二酚对氯化血红素的C-烷基化反应制得次氯血红素[15]. 目前的次血红素合成方法存在工艺繁琐、 收率低[16]或纯度低[17]等缺点. 本文以氯化血红素为原料, 经间二苯酚还原, 合成了次氯血红素. 采用多次重结晶方法获得了质量分数和收率均较高的产物, 该方法简单易行、 可大规模生产高质量分数的次氯血红素.

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 氯化血红素 (天津市生命科学应用研究所)； 间苯二酚、 N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、 三氟乙酸(TFA)、 乙酸乙酯、 二氯甲烷、 氢氧化钠和盐酸均为国产分析纯.

液相色谱仪(LC-2010HT, 日本岛津公司)和布鲁克基质辅助激光解析飞行时间质谱仪(ultrafleXtreme MALDI TOF/TOF, 美国布鲁克公司).

1.2 方 法

1.2.1 次氯血红素的合成 将10 g血红素与40 g间苯二酚混合置于三口瓶中, 油浴120 ℃搅拌30 min, 升至150 ℃反应30 min, 180 ℃反应20 min, 薄层色谱(TLC)监测至反应完全, 自然冷却至120 ℃后倒入10 L热水中, 搅拌, 过滤, 干燥, 称量, 制得次血红素粗品, 合成路线如图1所示. 采用液相色谱检测其质量分数(归一化法).

图1 次氯血红素的合成Fig.1 Synthesis of deuterohemin

液相色谱条件： 检测波长为390 nm； 色谱柱为C18柱(5 μm, 4.6 mm×250 mm)； 流动相为含w(TFA)=1%的V(乙腈)∶V(水)=35∶65溶液.

1.2.2 次氯血红素的重结晶 先将9.0 g次血红素粗品与0.1 mol/L的氢氧化钠溶液4.5 L混合后, 加入0.45 L DMF搅拌溶解, 过滤, 滤液用盐酸调至中性, 析出沉淀, 静置, 弃去上清液, 过滤, 收集沉淀. 重复操作2次, 将所得产物于120 ℃烘干1 h, 称重, 再用液相色谱检测其质量分数.

2 结果与讨论

2.1 间苯二酚用量对次氯血红素合成的影响 按1.2.1合成方法, 先将氯化血红素与间苯二酚分别以1∶3,1∶4,1∶5,1∶6的质量比投入反应, 制得次氯血红素粗品, 再用液相色谱检测其质量分数, 结果列于表1.

表1 间苯二酚用量对次氯血红素合成的影响

由表1可见, 当m(间苯二酚)∶m(氯化血红素)≤3时, 所得粗品的产率和质量分数均较低；m(间苯二酚)∶m(氯化血红素)≥6时, 粗品的产率较高, 但过量的间苯二酚需在纯化步骤中除去, 既浪费试剂， 也降低了产物的质量分数.

2.2 反应温度对次氯血红素合成的影响 按1.2.1合成方法, 先将氯化血红素与间苯二酚分别于170,180,190 ℃反应20 min, 制得次氯血红素粗品, 再用液相色谱检测其质量分数, 结果列于表2.

表2 反应温度对次氯血红素合成的影响

由表2可见: 当反应温度≤170 ℃时, 粗品的产率较低； 当反应温度≥190 ℃时, 副反应增加, 粗品的产率和质量分数均降低.

2.3 反应时间对次氯血红素合成的影响 按1.2.1合成方法, 先将氯化血红素与间苯二酚于180 ℃分别反应10,20,30 min, 制得次氯血红素粗品, 再用液相色谱检测其质量分数, 结果列于表3.

表3 反应时间对次氯血红素合成的影响

由表3可见: 当反应时间≤10 min时, 反应不充分, 产量较低； 当反应时间≥30 min时, 反应时间过长, 副反应增加, 粗品的产率和质量分数均下降.

2.4 重结晶溶剂对次氯血红素纯化的影响 先取1.2.1方法制得的次氯血红素粗品30 g, 分成3份, 每份10 g, 按1.2.2方法将其分别加入0.45 L的乙酸乙酯、 DMF和二氯甲烷中进行重结晶, 制得次氯血红素纯品, 计算收率, 再用液相色谱检测其质量分数, 结果列于表4.

表4 重结晶溶剂对次氯血红素纯化的影响

由表4可见: 当溶液为中性或酸性时, 次氯血红素从溶液中析出, 杂质保留在结晶母液中, 达到了纯化目的; 乙酸乙酯和二氯甲烷与二甲基甲酰胺相比, 其纯化效果较差.

2.5 重结晶溶剂比例对次氯血红素纯化的影响 先取1.2.1方法制得的次氯血红素粗品30 g, 分成3份, 每份10 g, 按1.2.2方法将其分别加入0.225,0.45,0.9 L DMF中, 制得次血氯红素纯品, 计算收率, 再用液相色谱检测其质量分数, 结果列于表5.

表5 重结晶溶剂比例对次氯血红素纯化的影响

由表5可见: 当V(DMF)=0.225 L时, 次氯血红素及杂质均在溶液中, 即溶剂化不充分; 当溶液为中性或酸性时, 次氯血红素与杂质同时析出, 导致其质量分数较低； 当V(DMF)=0.90 L时, 次氯血红素及杂质在溶液中溶剂化较充分, 析出次氯血红素的质量分数较高, 但溶剂过量, 使产率过低.

综上所述, 本文以氯化血红素为原料, 经间苯二酚还原制得次氯血红素粗品. 通过实验对比, 得到最佳反应条件:m(氯化血红素)∶m(间苯二酚)=1∶4 ; 反应温度为180 ℃; 反应时间为20 min. 选用0.45 L DMF做溶剂、 重结晶10 g 粗产品所得次氯血红素的质量分数大于95%、 产率大于85%. 该方法操作简单、 安全可控、 纯化效果好、 可以大规模生产.

[1] Jones P, Mantle D, Davies D M, et al. Hydroperoxidase Activities of Ferrihemes: Heme Analogs of Peroxidase Enzyme Intermediate [J]. Biochemistry, 1977, 16(18)： 3974-3978.

[2] Smith K M. Protoporphyrin Ⅸ: Some Recent Research [J]. Acc Chem Res, 1979, 12(10): 374-381.

[3] Portsmouth D, Beal E A. The Peroxidase Activity of Deuterohemin [J]. European Journal of Biochemistry, 1971, 19(4): 479-487.

[4] WANG Li-ping, LIU Ya-li, LI Wei, et al. Synthesis and Anti-cataract Activity of a Novel Peroxidase Mimetics [J]. Chemical Journal of Chinese Universities, 2004, 25(11)： 2171-2173. (王丽萍, 刘亚丽, 李惟, 等. 一个新的过氧化物酶模拟物的合成及抗白内障活性研究 [J]. 高等学校化学学报, 2004, 25(11)： 2171-2173.)

[5] WANG Di. Study on the Effects and Mechanism of DhHP-6 in Type 2 Diabetes Mellitus [D]. Changchun: Jilin University, 2008. (王迪. 亚血红素六肽抗2型糖尿病作用及机理研究 [D]. 长春: 吉林大学, 2008.)

[6] GUAN Shu-wen, LI Peng-fei, WANG Li-ping, et al. A Deuterohemin Peptide Extends Lifespan and Increases Stress Resistance inCaenorhabditiselegans[J]. Free Radic Res, 2010, 44(7): 813-820.

[7] GUO Chang-run, GUAN Shu-wen, WANG Li-ping, et al. DhHP-6 Protection ofCaenorhabditiselegansfrom Heat Shock Injury Induced by Au Nanoparticles [J]. Journal of Jilin University: Science Edition, 2012, 50(1): 153-156. (郭常闰, 关树文, 王丽萍, 等. 次血红素六肽对纳米金诱导线虫热激损伤的保护作用研究 [J]. 吉林大学学报: 理学版, 2012, 50(1): 153-156.)

[8] CHEN Xiao-guang, WANG Li-ping, LI Wei. Protective Effect of Deuterohaemin-His-6-Peptides Eye Drop (DhHP-6 Eye Drop ) on Galactose Cataract in Rats [J]. Chin Pharm J, 2009, 44(20): 1552-1555. (陈晓光, 王丽萍, 李惟. 亚血红素六肽滴眼液对大鼠半乳糖性白内障的预防作用 [J]. 中国药学杂志, 2009, 44(20): 1552-1555.)

[9] ZHAO Yu, BAO Xue-ying. Protective Effect of Deuterohemin His Peptide-6(DhHP-6) on Cerebral Ischema Reperfusion Injury in Rats [J]. J Apoplexy and Nervous Diseases, 2011, 28(8): 721-723. (赵玉, 包雪鹦. 亚血红素多肽对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用 [J]. 中风与神经疾病杂志, 2011, 28(8): 721-723.)

[10] GUAN Shu-wen， DUAN Leng-xin， LI Yuan-yuan, et al. A Novel Polypeptide from Cervus Nippon Temminck Proliferation of Epidermal Cells and NIH3t3 Cell Line [J]. Acta Biochimica Polonica, 2006, 53(2): 395-398.

[11] GUAN Shu-wen, LI Peng-fei, WANG Li-ping, et al. A Deuterohemin Peptide Extends Lifespan and Increases Stress Resistance inCaenorhabditiselegans[J]. Free Radic Res, 2010, 44(7): 813-820.

[12] WANG Li-ping， JIN Xin， HUANG Lei， et al. Mechanism of DhHP-6 on Extending Life Span inCaenorhabditiselegans[J]. Journal of Jilin University: Science Edition, 2012, 50(5): 1045-1048. (王丽萍, 金鑫, 黄磊, 等. DhHP-6延长秀丽线虫寿命的作用机制 [J]. 吉林大学学报: 理学版, 2012, 50(5): 1045-1048.)

[13] WEI Feng-hua, JIN Ying-zi. The Protective Effect of DhHP-6 on Fetal Rat Brain in Intrauterine Distress [J]. Maternal and Child Health Care of China, 2011, 26(2): 270-273. (尉凤华， 金英子. DhHP-6对宫内窘迫胎鼠脑保护作用 [J]. 中国妇幼保健, 2011, 26(2): 270-273.)

[14] GUAN Shu-wen. Study on the Molecular Mechanisms of Peroxidase Mimetic DhHP-6 on Extending Life Span inCaenorhabditiselegans[D]. Changchun: Jilin University, 2007. (关树文. 过氧化物酶模拟物DhHP-6在秀丽线虫中的抗衰老作用机制的研究 [D]. 长春： 吉林大学, 2007.)

[15] Winslow S C, James O, Wilfred Y F, et al. Subsdituted Deuteroporphyrins.Ⅰ.Reactions at the Periphery of the Porphyrin Ring [J]. J Org Chem, 1966, 31: 2631-2640.

[16] LIU Ya-li, GUO Li-li, Roeske R, et al. The Method Improvement of Synthyesis and Purification of Deuterohemin [J]. Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Jilinensis, 2001(1): 91-92. (刘亚丽, 郭莉莉, Roeske R, 等. 亚血红素的合成和纯化方法的改进 [J]. 吉林大学自然科学学报, 2001(1): 91-92.)

[17] MA Deng-sheng, HU Bing-cheng, LÜ Chun-xu. Study on the Synthetic Technology of Deuterohemin [J]. Fine Chemicals, 2008, 25(10): 1031-1033. (马登生, 胡炳成, 吕春绪. 次氯化血红素的合成 [J]. 精细化工, 2008, 25(10): 1031-1033.)