蜡蚧轮枝菌侵染黑刺粉虱体表过程的显微观察

曾 君，田 麟，王金明，王联德

(福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室，福建福州350002)

黑刺粉虱Aleurocanthus spiniferus(Quaintanca)在我国茶叶、柑桔、荔枝、龙眼等主要产区危害严重(任顺祥等，2011)。近年来在福建、广东、浙江、贵州等地严重为害茶树，2002年以来每年发生面积达10．6万hm2，每亩茶园平均减产1-2成，严重的减产3-4成，严重影响了茶业的生产;在福建、浙江、湖北、四川、重庆、贵州等地为害柑桔，每年发生面积达14．3万 hm2，被害株率达80%以上，严重影响产量和果实品质(任顺祥等，2011;胡雅辉等，2010)。近年来，黑刺粉虱造成的损失非常惨重，在我国很多地区仍有暴发成灾之势(肖伏莲等，2009;刘曼等，2010)。目前，对该虫的防治一般都采用化学农药为主，尽管短期内防治效果较好，但连续使用会引起害虫产生抗药性、杀伤其天敌引起再增猖獗和农药残留、影响产品卫生质量等问题，因而急需寻求与环境友好相容性的替代防治方法(王常平等，2011)。蜡蚧轮枝菌Lecanicillium lecanii(Zimmermann)Gams＆Zare的寄主范围广，能寄生蚧类、蚜虫类、螨类和粉虱(罗小刚，1982;陈吉棣，1985)，是具有良好应用前景的虫生真菌之一(Wang et al．，2004)。本研究以V3450菌株为材料，利用扫描电镜研究了蜡蚧轮枝菌对黑刺粉虱侵染过程中在体表萌发、生长和穿透体壁行为。以期探讨寄主与病原菌间的相互作用方式及关系。

1 材料与方法

1．1 供试菌株和虫体

供试菌株是从烟粉虱虫尸上分离的蜡蚧轮枝菌V3450菌株，保存于福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室。菌株经烟粉虱复壮后，接种到查氏固体培养基，在25℃、12L:12D智能人工气候箱中培养7 d备用。

供试昆虫黑刺粉虱种群采自福建农林大学后山茶场茶树，接到温室内盆栽的茶树上饲养，连续饲养多代后备用。

孢子悬浮液的制备:将培养的蜡蚧轮枝菌V3450菌株，平板内加20 mL 0．5% 吐温-80无菌水，用玻璃刮刀轻轻将表面刮下，经两层灭菌纱布过滤，制备成孢子悬浮液母液，用血细胞计数器测定每毫升母液的分生孢子含量，再用0．5%吐温-80无菌水将其配制成为108个·mL-1供试孢子悬浮液。

1．2 黑刺粉虱接菌及取样方法

瓷盘上放置湿润的花泥，将茶梢插在花泥上，茶梢接刚羽化的黑刺粉虱成虫10头，用玻璃筒(直径15 cm，高度25 cm，上端罩以纱布)罩住。将配制好的108个·mL-1分生孢子悬浮液，用手动喷雾器对着玻璃筒内茶叶及虫体喷雾，喷至茶芽叶菌液湿润为止。置于25℃、12L:12D智能人工气候箱中饲养。分别于接菌后12 h、24 h、72 h取样，保存于70%乙醇中。

1．3 电镜观察

从70%乙醇中保存的样品中挑选侵染的。样品在超声波清洗器(频率为50 kHz)中用蒸馏水清洗5 min清除表面污物后。将清洗干净的样品放入2．5%戊二醛溶液中置于4℃冰箱内固定过夜，将固定好的样品用0．1 mol·L-1磷酸缓冲液(pH 7．3)冲洗3次，每次10 min。然后用浓度为30%、50%、70%、80%、90%、95%和100%的酒精逐级脱水，每级10 min。再用锇酸后固定2 h。在PVT-3B型临界点干燥仪上CO2临界点干燥2 h。将干燥好的样品用双面胶将样品观察面朝上粘于样品台。用JFC-1200型镀膜仪真空喷金镀膜，置于JSM-5310LV型扫描电镜于15 kV加速电压下观察，拍照。

2 结果与分析

蜡蚧轮枝菌侵染黑刺粉虱成虫12 h、24 h、72 h后，用扫描电镜观察发现，蜡蚧轮枝菌在寄主体表主要分布在头部复眼(图1:A)、腹部(图1:B)、中足和后足(图1:C)、翅(图1:D)。接种蜡蚧轮枝菌V3450菌株孢子悬浮液12 h后，附着在虫体上的分生孢子萌发形成芽管，芽管伸长形成菌丝，沿虫体表面生长。接种后24 h菌丝侵入虫体，菌丝在沿寄主表面生长的同时还侧向长出芽管吸附在体表上，此时寄主体表出现大量菌丝。接种后72 h，萌发孢子在体表形成长的菌丝，相互缠绕，虫体被厚厚的菌丝层覆盖(图1:E)。表明蜡蚧轮枝菌附着到黑刺粉虱体表后能够在黑刺粉虱体表生长，一方面从复眼、腹部气孔、足基节和翅基等部位侵入黑刺粉虱体内，一方面在黑刺粉虱体表繁殖直到把黑刺粉虱包围在内，最终致使黑刺粉虱死亡。

蜡蚧轮枝菌V3450菌株的大量孢子成功附着于体壁不同区域，孢子可见萌发迹象，孢子一端会出现芽状体(图1:F，G)，侵染黑刺粉虱头部的蜡蚧轮枝菌孢子萌发后产生双芽管或三芽管(图1:H)。在寄主体表不同结构区，蜡蚧轮枝菌入侵行为存在一定差异，萌发形成长短不一的芽管。在平缓结构区和刺状结构区，接菌后12h，芽管末端膨大，孢子萌发伸出芽管(图1:F，G，H)，长度略短于孢子直径，一些芽管末端膨大形成附着结构——附着胞(图1:M，N)。在足及体节刺状突起区已出现芽管或各种附着结构向体壁穿透，在穿透点可见圆形小孔，小孔周围有粘状分泌物出现，为分泌的酶，芽管逐步伸长，多超过孢子纵轴长度，几经弯折向表皮定向生长(图1:I)。在侵染过程中，可看到芽管的菌丝出现分枝，开始生长，如侵染翅面、头部和复眼的芽管的菌丝出现分枝。头部芽管的菌丝分枝后伸向刚毛的基(图1:J);复眼的芽管的菌丝分枝伸向小眼间缝隙，从缝隙中进入虫体内(图1:K);翅面上的均匀密布的鳞毛状微刺，利于孢子的附着，孢子萌发后产生的芽管，分化出的菌丝分枝后，伸向翅的折褶和翅脉，形成附着胞，附着胞与翅的接触处有分泌物出现，为分泌的酶，有的形成了侵入钉(图1:J，K)。

附着胞形状多样，紧紧固着在结构区的平缓区域(如腹部节间膜)，随后进行寄透体壁。而在嵴状结构区(如布满微毛的翅)和刺状结构区(如中足和后足基节)，芽管常以原有直径延伸较长距离，并经几次弯折向体壁方向定向生长后，多数直接以芽管穿透体壁(图1:M)，少数形成L字形附着胞(图1:I，J，N)后再刺入体壁。

图1 蜡蚧轮枝菌对黑刺粉虱侵染过程Figure 1 Infection process of Lecanicillium lecanii on Aleurocanthus spiniferus

3 讨论

扫描电镜观察蜡蚧轮枝菌分生孢子侵染黑刺粉虱成虫体壁的过程，接种12 h后，附着在虫体上的分生孢子萌发形成芽管，24 h后菌丝侵入虫体，接种72h后虫体被厚厚的菌丝层覆盖。蜡蚧轮枝菌侵染朝鲜毛球蚧体壁过程中，蜡蚧轮枝菌侵染朝鲜毛球蚧Didesmocaccus koreanus 72 h后虫体腹面出现裂痕，裂缝部位夹着生大量菌丝，整个虫体被菌丝层包围。蜡蚧轮枝菌分生孢子侵染黑刺粉虱的过程也与此相似(韩珍珍，2010)。本实验观察到，分生孢子可以直接以芽管侵入表皮，也可以产生附着胞再侵入，穿刺点处出现的小孔及附着胞的周围发现分泌物，证实了蜡蚧轮枝菌在入侵黑刺粉虱过程中有酶的活动存在，酶对寄主表皮产生了降解作用。类似现象在蜡蚧轮枝菌侵染蚜虫Macrosiphoniella sanborni(Askary et al．，1999)和介壳虫 Didesmocaccus koreanus(韩珍珍，2010)、Ceropplastes japonicus(Liu et al．，2009)、Coccus hesperidum(Liu et al．，2011)过程中也报道过。

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